[发明专利]一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法

说明书

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润于肿瘤组织中以肿瘤抗原特异性CD4⁺、CD8⁺T细胞为主，同时包括B细胞和NK细胞的细胞群。因TIL与肿瘤细胞密切接触，理论上可以对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。TIL疗法是一种肿瘤特异性的细胞免疫疗法，将体外培养增殖后的TIL回输到体内，其在血液及肿瘤中可以长时间存活并行使杀伤功能。该方法具有高效、特异、副作用小等优点，可应用于实体瘤和各类晚期癌性胸、腹水患者的治疗。目前临床应用的TIL的来源主要有两个方面：1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2、癌性胸腹水。常规的TIL细胞培养方法受肿瘤大小、肿瘤浸润程度以及胸腹水量等诸多因素的限制，细胞在培养过程中的增殖速度慢、增殖倍率低，培养获得的细胞往往杀伤活性较差从而不能满足临床治疗的要求。此外，由于TIL不仅包含肿瘤杀伤性CD8⁺T细胞(CTL)，而且还包含抑制CTL抗肿瘤功能的调节型CD4⁺CD25⁺T细胞(Treg细胞)和髓系衍生抑制细胞(MDSC)。现有的TIL细胞扩增方法中往往通过使用大量IL-2的方式刺激肿瘤组织或胸腹水中淋巴细胞增殖，然而IL-2用量过高可使培养的TIL中CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量增加，令其难于有效发挥肿瘤杀伤效应，导致肿瘤免疫逃逸发生。因此有必要开发一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术从而为其临床应用提供技术支持。

发明内容

本公开的目的是提供一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术。

为了实现上述目的，本公开提供一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；

所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；

所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；

所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。

可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种。

可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15。

可选地，所述单克隆抗体为CD3单克隆抗体、CD134单克隆抗体和PD-1单克隆抗体中的至少一种。

可选地，所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基中的至少一种，所述灭活动物血清为胎牛血清。

可选地，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：

香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。

可选地，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：

IL-7 5-15ng/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.2-1.6。

可选地，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：

胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：2-4。

本公开的第二个方面还提供了一种TIL细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开第一个方面所述的TIL细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：

诱导培养：将TIL细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；

增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养7-12天获得增殖培养细胞；

活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。

可选的，所述方法还包括从胸腹水中提取TIL细胞：