[发明专利]一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种热稳定性得到改善的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用，具体地，本发明提供了一种突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，所述突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶在野生型的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的对应于SEQ ID NO.:1的第122位赖氨酸(K)、第195位甘氨酸(G)发生突变，本发明的突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶具有非常优异的热稳定性，此外，本发明的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶还具有很高的催化效率(高达29％)。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿、预防肥胖等生理功能。2011年美国FDA认可D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。自此D-阿洛酮糖的开发得到了迅速发展。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，且极难获得。来源于野生菌株未经改造的DPE酶在热稳定性方面较差，工业应用存在一定的局限性，导致酶的使用时间偏短，应用成本偏高，限制了D-阿洛酮糖的大规模工业化生产。因此，热稳定性好的DPE酶的资源仍然偏少，不利于D-阿洛酮糖的工业化应用推广。

因此，本领域迫切需要开发一种热稳定性好、催化效率高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热稳定性好、催化效率高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明第一方面提供了一种突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在野生型的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的对应于SEQ ID NO.:1的第122位赖氨酸(K)、第195位甘氨酸(G)发生突变。

在另一优选例中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自于类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)。

在另一优选例中，所述第122位赖氨酸(K)突变为丙氨酸(A)；和/或

第195位甘氨酸(G)突变为脯氨酸(P)。

在另一优选例中，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示。

在另一优选例中，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特征：

(a)催化效率≥25％，较佳地，26-40％，更佳地，27-30％；

(b)在50-70℃(较佳地，60℃)，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的半衰期为野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶半衰期的130％～350％，较佳地，150％～280％；

(c)所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在50-70℃(较佳地，60℃)的半衰期≥200min，较佳地为220-500min，更佳地，230-400min；

(d)所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的比酶活在50-70℃(较佳地，60℃)处理后的降低程度为野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的比酶活的降低程度的40-80％，较佳地，50-70％。

在另一优选例中，所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶除122、195位氨基酸外，其余氨基酸与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化合成阿洛酮糖的活性。