[发明专利]有效建立诱导的多能干细胞的方法

说明书

本申请是国际申请日为2009年7月30日、国际申请号为PCT/JP2009/063906、进入国家阶段的申请号为200980100065.0、发明名称为“有效建立诱导的多能干细胞的方法”的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及改善诱导的多能干细胞(下文称为iPS)建立效率的方法。更具体而言，本发明涉及改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程(nuclear reprogramming)步骤中在低氧条件下培养体细胞。

背景技术

近年来，小鼠和人iPS细胞已相继建立。Yamanaka等人通过下列诱导iPS细胞：将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因引入来自报道小鼠(reporter mouse)的成纤维细胞内，其中将新霉素抗性基因敲入Fbx15基因座内，并且迫使细胞表达该基因(1，2)。Okita等人(3)通过下列成功地建立了iPS细胞(Nanog iPS细胞)，所述iPS细胞显示与胚胎干(ES)细胞中的那些几乎相同的基因表达和后生修饰：产生转基因小鼠，其中绿色荧光蛋白(GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座内，它们的表达比Fbx15表达更集中于多能细胞中，迫使得自小鼠的成纤维细胞表达上述4种基因，以及选择嘌呤霉素抗性和GFP阳性的细胞。相似结果也由其他小组获得(4，5)。其后，揭示iPS细胞也可以利用除c-Myc基因之外的3种因子来产生(6)。

此外，Yamanaka等人通过将与小鼠中所使用的那些相同的4种基因引入人皮肤成纤维细胞内成功建立了iPS细胞(1，7)。另一方面，Thomson等人的小组使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞(8，9)。Park等人(10)使用TERT和SV40大T抗原加上4种因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞，其中所述TERT被认为是人细胞无限增殖基因。因此，已证实就通过将所限定的因子引入到体细胞内在人和小鼠二者中所能够产生的多能性而言，iPS细胞与ES细胞相当。

然而，iPS细胞建立效率低至小于1％。特别地，当通过引入除c-Myc外的3种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)而产生它们时，会出现极低效率的iPS细胞建立的问题，其中，担心c-Myc在组织中会引起肿瘤发生和由iPS细胞分化的个体成为体细胞。

顺便提及，可获得关于细胞的未分化状态和多能性的维持与低氧条件之间的关联的某些报告。Ezashi等人(11)观察到在低氧条件下培养的人ES(hES)细胞的分化被抑制，暗示在低氧条件下培养以维持关于hES细胞的足够多能性的必要性。Covello等人(12)显示在低氧条件下早期被诱导的转录调节因子(HIF-2α)能够诱导Oct3/4的表达，并且调节干细胞的功能和分化。此外，Grayson等人(13，14)显示低氧条件参与人间质干细胞(hMSCs)的未分化状态和多能性的维持。然而，没有关于已经分化的体细胞中的核重编程过程和低氧条件之间的关系的报告。

提及的参考文献：

1.WO 2007/069666 A1

2.Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126：663-676(2006)

3.Okita，K.等人，Nature，448：313-317(2007)

4.Wernig，M.等人，Nature，448：318-324(2007)

5.Maherali，N.等人，Cell Stem Cell，1：55-70(2007)

6.Nakagawa，M.等人，Nat.Biotethnol.，26：101-106(2008)

7.Takahashi，K.等人，Cell，131：861-872(2007)

8.WO 2008/118820 A2

9.Yu，J.等人，Science，318：1917-1920(2007)

10.Park，I.H.等人，Nature，451：141-146(2008)

11.Ezashi，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：4783-4788(2005)

12.Covello，K.L.等人，Genes&Dev.，20：557-570(2006)

13.Grayson，W.L.等人，J.Cell.Physiol.，207：331-339(2006)