[发明专利]使用重组嗜盐甲烷氧化菌生产异戊二烯的方法

说明书

本发明涉及具有生产异戊二烯能力的重组甲烷氧化菌以及使用其生产异戊二烯的方法，更具体地涉及具有生产异戊二烯能力的重组甲烷氧化菌和使用此重组甲烷氧化菌生产异戊二烯的方法，其中该重组甲烷氧化菌中引入了编码与甘薯(Ipomoea batatas)异戊二烯合酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的异戊二烯合酶的基因。使用本发明的重组甲烷氧化菌能够利用获取自废弃物如天然气、生物质、城市垃圾等的甲烷气体或甲醇作为碳源以高产率生产异戊二烯。

技术领域

本发明涉及具有生产异戊二烯能力的重组甲烷氧化菌以及使用其生产异戊二烯的方法，更具体地涉及其中引入了编码与甘薯(Ipomoea batatas)异戊二烯合酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的异戊二烯合酶的基因并具有生产异戊二烯能力的重组甲烷氧化菌以及使用此重组甲烷氧化菌生产异戊二烯的方法。

背景技术

类异戊二烯是可用于药物、营养品、香料、芳香剂、香水和橡胶产品的异戊二烯聚合物。异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是不溶于水但可溶于醇的挥发性烃。可以通过从石油C5裂解级分中直接分离得到或通过C5异烷烃或异烯烃的脱水得到商业上可行的量的异戊二烯(Weissermel和Arpe,Industrial Organic Chemistry(工业有机化学),第四版,Wiley-VCH,117-122页,2003)，并且C5骨架也可以由较小的亚单元合成。

异戊二烯的生物合成通过两种不同的代谢途径发生(Julsing等，Appl MicrobiolBiotechnol,75:1377-1384,2007)。在真核生物和原生生物中，异戊二烯经由甲羟戊酸(MVA)途径合成，而在一些细菌和高等植物中，异戊二烯经由甲基赤藓醇磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途径合成。植物散发异戊二烯依赖于光和温度，并随着叶的发育而增加。已在白杨(Aspen)树中鉴定出异戊二烯合酶，即异戊二烯生产酶(Silver和Fall,Plant Physiol,97:1588-1591,1991；以及Silver和Fall,J Biol Chem,270:13010-13016,1995)，并认为异戊二烯合酶负责全部叶子中异戊二烯的体内生产。还报道了异戊二烯的细菌生产(Kuzma等,Curr Microbiol,30:97-103,1995；Wilkins,Chemosphere,32:1427-1434,1996)，并且生产量随细菌生长阶段和培养基中营养物的含量而变化(美国专利第5,849,970号；Wagner等，J Bacteriol,181:4700-4703,1999)。

然而，由现有技术中的细菌系统获得的异戊二烯的水平不足以用于商业用途。因此，需要一种有效的、大规模的、细菌生产异戊二烯的方法来提供用于制造类异戊二烯的原料。

另一方面，在C1化合物中，甲烷气体由天然气和合成气低成本地制造，其中合成气为通过焚烧诸如生物质、城市垃圾等的废弃物得到的一氧化碳、二氧化碳和氢的混合气体。天然气作为下一代能源引起人们的关注，因为它大量存在于化石资源中并产生相对少量的CO₂。因此，正在发生从常规石油向天然气的转变。

甲烷氧化菌是采用分子中不具有C-C键的碳化合物(如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等)作为唯一碳源或能源的同化C1化合物的微生物的总称。称为甲烷氧化菌(methanotroph)、甲烷氧化细菌(methane-oxidizing bacteria)、甲醇同化菌(methanolassimilating bacteria)、甲醇同化酵母、甲醇同化微生物的任何微生物均属于甲基营养菌(methylotrophs)。甲基营养菌的主要代谢反应是在将甲醇转化为甲醛之后再将甲醛转化为具有C-C键的有机物的反应。

作为使用甲烷氧化菌生产异戊二烯的方法，报道了几种包含从外部引入异戊二烯合酶的方法。然而，当将外源基因异戊二烯合酶引入甲烷氧化菌中时，存在甲烷氧化菌不具有足够的生产异戊二烯能力的缺点，因此异戊二烯产量低(US2015-0225743；KR2015-0100666；WO2014-138419；WO2014-089436)。