[发明专利]一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法

说明书

一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法，包含山羊淋巴细胞信号活化因子Slam引物序列，Slam慢病毒表达载体构建，Slam复制缺陷型慢病毒的获得，Slam慢病毒感染靶标细胞Vero，敏感细胞亚克隆Vero/Slam的筛选、验证，增强小反刍兽疫病毒PPRV易感性的验证等。本发明包括具有提高PPRV复制能力的阳性细胞亚克隆，该细胞亚克隆具有良好的生物学特性以及遗传稳定性，其稳定表达的Slam具有明显增强PPRV复制的功效。

技术领域

本发明涉及生物学领域中敏感细胞亚克隆的制备技术，特别涉及一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)由小反刍兽疫病毒(Peste despetits ruminants virus，PPRV)引起，以高热(40℃以上)、结膜炎、眼、鼻黏液性或脓性分泌物、口腔溃疡、咳嗽、恶臭的腹泻为主要临床特征，肺炎和出血性肠炎为主要病理变化的急性、热性、高度接触性传染病。该病属于副黏病毒科(Paramyxo-viridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，同属的还有牛瘟病毒(Rinderpestvirus,RPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper，PDV)、海豚瘟病毒(Dolphin distemper，DDV)和麻疹病毒(Measles Virus,MV)。病毒分离和鉴定是当前流行PPRV毒株生物学特性研究的基础，但PPRV在Vero(非洲绿猴肾细胞)、BHK-21(乳仓鼠肾细胞)、PK-15(猪肾细胞)等常用的细胞系上或不易适应，或不产生典型细胞病变(CPE)，或传代几次后病毒丢失，分离率较低，影响和限制了对PPRV野毒株的分离、生物学特性和致病机制的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以分离到高滴度小反刍兽疫病毒的不足，构建靶向小反刍兽疫病毒特定细胞受体的慢病毒载体介导稳定整合的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法，包括山羊信号淋巴细胞激活分子Slam引物序列，通过构建山羊Slam慢病毒表达载体，获得Slam复制缺陷型慢病毒样粒子，以获得的Slam慢病毒样粒子感染Vero靶标细胞，筛选稳定表达Slam的Vero阳性细胞亚克隆，验证阳性细胞亚克隆Vero/Slam表达的Slam活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。

所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2包括：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGATCACAAAGGGCTCCTCTCCT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTTCAGCTCTCTGGAACCGTCACA。

所述Slam慢病毒表达载体构建，包括Slam与pDONR^TM221供体载体进行B、P位点重组获得入门载体pDONR/Slam，以及pDONR/Slam与pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表达载体进行L、R位点重组获得表达克隆pDEST/Slam。

所述Slam完整慢病毒的获得，是将pDEST/Slam质粒与包装混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同转染人胚肾细胞株293-FT，收获细胞上清，获得具有感染性的Slam复制缺陷型慢病毒样粒子。