[发明专利]流式细胞术快速检测大肠杆菌O157:H7的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品快速检测领域，涉及食源性致病菌大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的快速检测，尤其是一种基于流式细胞术的荧光定量检测食品中的食源性致病菌的检测方法。

背景技术

食源性疾病长期损伤我们的脏器并有致命性。主要的食源性致病菌包括Salmonella enteric subspecies I serovar Typhimurium,Escherichia coli O157:H7,Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,Campylobacter jejuni,Clostridium perfringens,和Yersinia enterocolitica，它们对食品工业和消费者产生了巨大影响。2010年5月传染病研究与政策中心(CIDRAP)宣布：美国农业部(USDA)最新估计每年E.coli和Salmonella花费近31.3亿美元。在北美、英国和日本，E.coli O157：H7是EHEC致病菌中最重要的，属于主要食源性致病菌的前五位之一，曾报道在菠菜、生菜、苹果酒、哈密瓜、萝卜芽以及碎牛肉中有污染，感染剂量小于100个菌体细胞。E.coli O157:H7的传染主要是经过粪口途径，但是也可以通过接触被污染的水源、感染动物或人类进行感染，主要导致肠道疾病。在美国1990年至2010年期间，由E.coli爆发引起的食品安全事件有361起，其中由E.coli O157:H7引起的有303起，在美国平均每年导致9,6000人感染，31人死亡。

一个有效的途径来阻止污染的商业食品被引入人类食物链就是在最初的控制点进行监测。因此在食品安全中对于食品中微生物致病菌的识别和检测预防有重要意义。在根据Arnandis-Chover等最近的报道，在2011年欧洲就有进行了27.5千万次的食品中微生物检测试验，预计到2016年会有35千万次的食品微生物检测试验。

传统检测致病微生物的方法主要依赖于特异性的微生物和生化鉴定。如图1所示，传统方法有：培养和菌落计数法，基于免疫学的方法以及PCR(polymerase chain reaction)方法^[5]。这些方法很灵敏、费用低廉并且可以定性和定量判定被检微生物，但是它们很大程度上被检测时间所限制，并且如果要检出食品样品中低浓度的致病菌就需要进行样品的前富集。

综上可知传统方法通常费时，这就需要一个新的技术能快速、简便、特异、灵敏、可靠地检测食源性致病菌。而且这种新技术应该可以较低的成本在原地实时监测。生物传感器是对生物物质敏感并将其响应转换为可识别的信号进行检测的分析仪器。主要由两部分组成：可以识别靶标分析物的生物识别元件和能把识别信号转换为可测量的电信号的换能器。生物识别元件可以是组织、微生物、细胞器、细胞、酶、抗体、核酸和仿生材料等。近年来随着细胞生物学的飞速发展，细胞作为生物传感器的识别元件被用于致病菌的检测中已经日益突显了其无可比拟的优越性。一些基于哺乳动物细胞的CBBs的检测系统已经达成了商业化，诸如(a)电细胞基质的阻抗传感器(electric cell-substrate impedance sensing，ECIS)可以检测细胞培养物中的阻抗改变，该方法检测时间较长；(b)CANARY系统，在B细胞(B淋巴细胞)表面构建了致病菌特异性的抗体，在B细胞质内表达生物发光钙离子响应蛋白，当抗原与B细胞表面的抗体结合后启动信号通路从而导致胞内的钙离子激流可使B细胞发光，可以用光度计进行检测，该方法虽然检测时间较短，但是样品需要通过离心的方法进行前富集；(c)生物电识别系统(BERA)使用了电穿孔的方法构建了抗体或其他分子到哺乳动物细胞膜，当结合了诸如病毒粒子的分析物后，抗体就开启了膜电位的改变，这可以用微电极检测到，该方法的工作电极不可重复利用。

这类哺乳动物细胞的CBBs被用于食品、农业和生物安全方面的致病性微生物和毒素的检测，在生物传感器领域的增长率达到了11.2％，这说明了在该领域需要发展新型的功能化的CBBs。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出染色后的细菌数量。