[发明专利]全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片及其制作和应用

权利要求书

1.全血中血红蛋白含量检测的纸基微流控芯片，其特征在于，包括3个功能区域，纸基芯片I区用于胞浆分离后的细胞洗脱，纸基芯片II区用于全血进样与胞浆分离及后期电化学检测，纸基芯片III区用于细胞裂解后血红蛋白洗脱，所述的纸基芯片I区和III区包含不同数目阵列微缝的扇形洗脱池，所述的纸基芯片II区包含由银/氯化银参比电极、亚甲蓝修饰的抛光碳工作电极和对电极组成的丝网印刷三电极系统。

2.全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤，

(1)、用绘图软件设计纸基芯片II区的工作电极(17)和对电极(19)的电极系统，工作电极(17)和对电极(19)垂直设置，以该设计为模板加工成丝网印刷的电极网板A，在色谱纸正面通过电极网板A丝网印刷碳浆，获得包含碳工作电极(17)和碳对电极(19)的色谱纸，放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(2)、用绘图软件设计只包含参比电极(18)的银/氯化银电极模板，并加工成丝网印刷的电极网板B，在包含烘干的碳工作电极(17)和碳对电极(19)的色谱纸正面，通过网板B丝网印刷银/氯化银浆，得到包含碳工作电极(17)、碳对电极(19)和银/氯化银电极(18)的三电极系统的色谱纸，将三电极系统的色谱纸放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(3)、用绘图软件设计全血纸基微流控芯片的疏水结构模板，包括纸基芯片I区、II区和III区，其中纸基芯片I区和III区结构相同均包含八个亲水的未加工扇形洗脱池(25)和一个中心连接池(26)，纸基芯片II区整体为疏水结构，以该疏水结构模板为依据加工成疏水结构网板C，疏水结构在包含三电极的色谱纸的背面通过网板C丝网印刷质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS的液态胶，在预热的150℃烘箱中加热1小时，使PDMS疏水障碍干燥的同时活化碳电极，每次印刷过程都需位置校准；

(4)、再设计激光刻蚀微缝加工模板图，在与纸基芯片I区和III区的八个亲水的未加工扇形洗脱池(25)相契合的位置设计平行阵列的激光刻蚀微缝，八个亲水的未加工扇形洗脱池(25)依次交替分布具有不同密度的激光刻蚀微缝(27、28)，通过激光刻蚀仪以及设计的微缝加工模板图，在包含三电极和疏水结构单元的色谱纸正面，以激光刻蚀仪最大强度16％的激光强度和最大刻蚀速度70％的激光速度加工微缝结构，激光刻蚀开始前进行位置校准，获得包含阵列微缝结构的八个亲水的微缝扇形洗脱池(9-16)的芯片I区，芯片III区具有相同结构；

(5)、设计激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，在纸基芯片I区亲水的中心连接池(26)设计八条剪切线，将中心连接池(26)分成8个同等大小的扇形区(1-8)，在纸基芯片II区设计圆形结构，在纸基芯片III区亲水的中心连接池同样设计八条剪切线，在芯片I、II和III区的连接位置设计10条剪切线(a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l)，在芯片II区设计折叠线(b-h和e-k)，在所得的色谱纸正面同样通过激光刻蚀仪，以30％激光强度和100％的激光速度加工步骤(5)设计的激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，获得一个镂空的第一进样区(20)26条剪切线以及两条折叠线的纸基微流控芯片；

(6)、对纸基微流控芯片上的碳工作电极和碳对电极表面进行抛光处理，用砂纸在碳工作电极(17)和对电极(19)表面，沿同一方向用力均匀的打磨去除电极表面钝化的碳层，得到抛光的碳电极表面(23)，再用超纯水清洁碳工作电极和碳对电极表面，洗去碳电极表面打磨产生的微细碳颗粒，清洗电极过程中超纯水只流经或接触芯片II的疏水区域，严禁污染芯片亲水位置；

(7)、通过物理吸附法将亚甲蓝修饰到碳工作电极上：将亚甲蓝添加到pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，搅拌半小时，配置成40mM的亚甲蓝溶液，以体积比为1000:1的比例配置亚甲蓝-Triton X.100混合溶液，混合均匀静置20分钟，分别将亚甲蓝溶液均匀滴到打磨过的碳工作电极和碳对电极表面，并将其置于防潮柜内避光干燥12小时；

(8)、在芯片II的色谱纸正面镂空的第一进样区(20)粘贴与对应区域尺寸相同的1.2μm全血分离膜(21)，得到第二进样区(24)；最终得到抛光修饰过的纸基微流控芯片成品。

3.全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、沿全血纸基微流控芯片上的剪切线(a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l)将整个纸基微流控芯片分离成芯片I区、芯片II区、芯片III区，使之成为单独的3个小芯片，同样沿芯片I区和芯片III区中心连接池(26)的剪切线将八个扇形亲水区(1-8)分离，这些扇形亲水区均能够向上或向下翻折；

(2)、将芯片II区沿折叠线(b-h和e-k)翻折，再将芯片II区的第二进样区(24)置于芯片I的中心连接池(26)上方位置，使两个芯片堆叠在一起，此时八个扇形亲水区(1-8)向下翻折与芯片II区的第二进样区(24)无有效连接；

(3)、将第一扇形亲水区(1)和第五扇形亲水区(5)向上翻起，保持其他扇形亲水区位置不变，使包含密集微缝的第一微缝扇形洗脱池(9)和第五微缝扇形洗脱池(13)与芯片II区的第二进样区(24)相连接，在第二进样区(24)滴加新鲜血液，再在第二进样区(24)滴加pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗脱，磷酸缓冲液流过与第二进样区(24)紧密相连的第一扇形亲水区(1)和第五扇形亲水区(5)，快速流向包含密集微缝的第一微缝扇形洗脱池(9)和第五微缝扇形洗脱池(13)，该过程中血浆中小分子物质溶于磷酸缓冲液，通过全血分离膜被带走，而血细胞保留在全血分离膜上，等磷酸缓冲液被第一微缝扇形洗脱池(9)和第五微缝扇形洗脱池(13)完全吸收后，将第一扇形亲水区(1)和第五扇形亲水区(5)向下翻折，第一次洗脱结束；将第三扇形亲水区(3)和第七扇形亲水区(7)向上翻起，使包含密集微缝的第三微缝扇形洗脱池(11)和第七微缝扇形洗脱池(15)与芯片II区的第二进样区(24)相连接，接着在第二进样区(24)滴加pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗脱，待磷酸缓冲液被第三微缝扇形洗脱池(11)和第七微缝扇形洗脱池(15)完全吸收后，将第三扇形亲水区(3)和第七扇形亲水区(7)向下翻折，完成第二次洗脱；

(4)、将第二扇形亲水区(2)和第六扇形亲水区(6)向上翻起，使包含较疏松微缝的第二微缝扇形洗脱池(10)和第六微缝扇形洗脱池(14)与芯片II区的第二进样区(24)相连接，在第二进样区(24)滴加质量分数为0.9％的氯化钠溶液进行第三次洗涤，该过程去除杂质蛋白，同样等生理盐水被第二微缝扇形洗脱池(10)和第六微缝扇形洗脱池(14)完全吸收后，将第二扇形亲水区(2)和第六扇形亲水区(6)向下翻折，并将第四扇形亲水区(4)和第八扇形亲水区(8)向上翻起，使第四微缝扇形洗脱池(12)和第八微缝扇形洗脱池(16)与第二进样区(24)相连接，滴加生理盐水进行第四次洗脱，待生理盐水被第四微缝扇形洗脱池(12)和第八微缝扇形洗脱池(16)完全吸收后，将芯片I区和芯片II区分离，完成胞浆预分离和血细胞洗涤过程；

(5)、在芯片II区的第二进样区(24)加入去氧胆酸钠溶液，溶化红细胞，释出血红蛋白，再在加入第二进样区(24)加入亚硝酸钠溶液将血红蛋白转化成高铁血红蛋白，以消除由于氧化造成的检测误差，完成细胞裂解及血红蛋白释放过程；

(6)、芯片II区的第二进样区(24)与芯片III的中心连接池(26)堆叠连接起来，芯片III除去血细胞中干扰杂质的使用过程与芯片I类似，先使用密集微缝的第一微缝扇形洗脱池(9)和第五微缝扇形洗脱池(13)通过pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗涤，第三微缝扇形洗脱池(11)和第七微缝扇形洗脱池(15)通过pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗涤，两次洗涤去除血细胞裂解后释放的小分子物质，再用较疏松微缝的第二微缝扇形洗脱池(10)和第六微缝扇形洗脱池(14)通过乙醇进行第三次洗涤，第四微缝扇形洗脱池(12)和第八微缝扇形洗脱池(16)通过乙醇进行第四次洗脱，该过程乙醇迅速挥发同时去除脂溶性有机物，洗涤完毕后，将芯片I区和芯片II区分离，完成干扰杂质的分离过程；

(7)、在第二进样区(24)滴加pH＝7.4磷酸缓冲液，随之将芯片II区沿折叠线(b-h和e-k)翻折，使保留在第二进样区(24)的待检测的纯化血红蛋白与打磨的碳工作电极表面(17)、打磨的碳对电极表面(19)以及银/氯化银电极(18)有效的连接起来，再将三电极连接到外部设备电流信号检测装置，亚甲蓝具有良好的氧化还原性，在0.17V和0.27V处分别有氧化峰和还原峰，有血红蛋白存在时氧化峰电流相应减小，同时还原峰电流相应增大，该过程亚甲蓝催化血红蛋白的还原，并起到加速电极和血红蛋白之间电子传递的作用，通过循环伏安法，记录峰电流即可检测全血中的血红蛋白含量。