[发明专利]一种小分子蛋白或多肽的制备方法及融合蛋白

权利要求书

1.一种小分子蛋白或多肽的制备方法，所述方法包括：

（a）构建基因工程菌株，该基因工程菌株包含具有融合蛋白编码核酸序列的重组表达载体，所述融合蛋白为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽；

（b）培养所述基因工程菌株，以表达所述融合蛋白；和

（c）纯化所述融合蛋白并通过蛋白酶切割得到具有生物活性的所述小分子蛋白或多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌株选自细菌、酵母和真菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程菌株是细菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程菌株是大肠杆菌（Escherichia coli）。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接肽具有以下通式：X_n------X₃-X₂-X₁-X₀，其中，n为2~8之间的整数；X₀为蛋白酶酶切位点，选自Arg、Lys；X₁和X₂是酸性氨基酸，即Glu或Asp；X₃~X_n选自除Lys和Arg以外的任何氨基酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组表达载体具有T7启动子或T7 lac启动子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达载体还额外具有T7终止子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（c）具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过蛋白酶酶切释放小分子蛋白或多肽。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（c）具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过侧链修饰得到小分子蛋白或多肽的前体，最后通过蛋白酶切割得到具有生物活性的小分子蛋白或多肽。

10.一种融合蛋白，其通式为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽。

11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述醛固酮异构酶蛋白突变体或人胰高血糖素样肽-1突变体是由相应的野生型蛋白经过一个或多个氨基酸突变得到，以消除特定蛋白酶切割位点，或者消除侧链修饰位点。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中融合伴侣醛固酮异构酶蛋白或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。

13.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中融合伴侣人胰高血糖素样肽-1或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示。