[发明专利]一种高生长能力隐甲藻突变藻株的选育方法

说明书

本发明公开了一种基于脂肪酸合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)作为选择压力的隐甲藻突变藻株选育方法，包括隐甲藻藻株常压室温等离子体(ARTP)诱变和在乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)的选择压力下的突变藻株筛选方法，以及在乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)的选择压力下的隐甲藻藻株的驯化方法。本发明的特征是将常压室温等离子体诱变技术和基于乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)的藻株筛选方法结合，以及基于乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)的藻株驯化方法，相对于已有的隐甲藻藻株选育方法，具有能够高效、快速获得高生长能力藻株的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种高生长能力隐甲藻突变藻株的选育方法。

背景技术

由于多元不饱和脂肪酸对人体的生理功能起着重要作用，其研究和生产日益受到人们的重视。其中，ω-3类不饱和脂肪酸中的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是极为重要的一种具有高营养价值的脂肪酸，对婴儿大脑的正常发育、成人大脑功能的正常发挥有重要作用。此外，DHA对于人体视网膜以及人体心血管疾病预防起着重要作用。人体自身不能合成DHA，必须从食物中摄取。

直至目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源有着一些致命的问题，比如海洋污染造成的对鱼油的安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)、易受环境污染、纯化成本高，尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑；另外，鱼油的特殊气味也限制了从鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。

利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。

目前，实际隐甲藻发酵生产应用的藻种多数从自然界直接分离获得，性状较为单一，在发酵过程中难免发生藻株种质退化。而利用传统方法选育优良藻种，周期长，工作量大。因此，隐甲藻藻株种质的改进对于促进隐甲藻生产DHA产业的可持续发展是十分重要的。

常压室温等离子体(ARTP)是指能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。由于ARTP本身的温度低、活性粒子浓度高且种类多样，且ARTP放电形式多样、设备简单、操作简易、运行成本低廉，加之ARTP本身对环境无污染和损害，所以常压室温等离子体(ARTP)诱变在生物领域应用越来越广泛。ARTP富含的活性能量粒子对菌株/植株/细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。

常规隐甲藻突变株的大多数筛选方法耗时较长，且工作量较大，效率不高。因此，寻求一种高效的筛选方法对于隐甲藻藻株的选育也是极为重要的。

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase)是催化乙酰辅酶A+ATP+HCO₃-→丙二酰辅酶A+ADP+Pi反应的生物素酶。此反应制约着脂肪酸合成第一阶段的速度，因此乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸合成的关键酶。而稀禾定(sethoxydim，2一[1一(乙氧基亚氨基)丁基]一5一[2一(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮)是该酶的抑制剂。稀禾定会抑制隐甲藻的脂肪酸合成而导致生长缓慢甚至死亡。

到目前为止，没有使用稀禾定进行隐甲藻突变株进行筛选的报道。