[发明专利]一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体

说明书

本发明涉及一种人源程序性死亡受体hPD‑1单克隆抗体的制备方法，属于抗体的制备方法技术领域。包括以下步骤：hPD‑1胞外段重组基因的构建；hPD‑1胞外段蛋白的制备；将制备好的抗原注射到Balb/c小鼠体内；再加强免疫3次后采血，ELISA检测血清效价；取效价达到要求的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；杂交瘤细胞的克隆化培养；将克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，即可获得抗体浓度很高的腹水单抗；利用Protein A填料纯化单克隆单体。本发明的方法制备的hPD‑1的单克隆抗体在免疫组化的结果上具有较强的膜定位和具有高特异性、敏感度高、纯度高的优点。

技术领域

本发明属于抗体的制备方法技术领域，具体涉及一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。

背景技术

众所周知，初始T细胞活化离不开抗原肽-MHC分子复合物与T细胞表面受体（TCR）的相互作用，但同时需要抗原呈递细胞表面（APC）的共刺激分子与其表面的相应受体结合来提供第二刺激信号。B7家族作为唯一能从APC单向传送信号至T细胞的共刺激分子，可以调控免疫信号的强度、持续时间和过程。人源程序性死亡分子1（hPD-1）是B7家族的一员，是重要的免疫抑制分子，与其配体PD-Ls结合后，可激活细胞内的抑制信号，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖以及IL-2和IFN-γ等细胞因子的分泌，从而抑制免疫应答反应，参与调节免疫耐受，导致微生物感染和肿瘤细胞的免疫逃逸。hPD-1可表达在激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞等免疫细胞上，属于免疫球蛋白家族。因此，hPD-1作为肿瘤发生、发展、转移以及肿瘤预后的重要指标，需要准确和高灵敏的免疫组化技术对其检测。

免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上以免疫学的抗原抗体反应为理论基础发展起来的技术，可对组织和细胞内的特定抗原或抗体(多肽和蛋白质)进行定位、定性或定量检测。目前，免疫组化技术在临床检测的应用包括良性和恶性肿瘤的诊断与鉴定、肿瘤分期、肿瘤来源的鉴定、区分组织器官交界处肿瘤、发现微小转移灶和指导肿瘤的治疗。因此，有必要制备高纯度、高特异性的hPD-1单克隆抗体，利用免疫组化技术指导肿瘤的诊断和治疗。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。

为此采用如下的技术方案：

一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示，轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

所述抗体为如下1）或2）所示的蛋白质：

1）重链与轻链可变区由SEQ ID NO.1-4所示的碱基序列或氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将SEQ ID NO.1-4所示的轻链和/或重链可变区的碱基序列或氨基酸序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质的轻链和/或重链可变区。

所述抗体的轻链和/或重链可变区编码DNA分子，所述编码DNA分子为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）其轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列所示；

2）与SEQ ID NO.1-4中序列限定的DNA分子杂交且编码权利要求1-2中任一所述抗体的DNA分子；

3）与1）的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1-2中任一所述的抗体的DNA分子。

所述的单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。

任一所述的抗体在如下a）-c）中任一种中的应用：