[发明专利]一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用

说明书

本发明提供了一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用，涉及基因工程技术领域。该信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列，或者是由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。该信号肽具有引导目的蛋白例如β‑内酰胺酶进行分泌表达的作用，且相应的目的蛋白具有生物活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用。

背景技术

蛋白质是一类大分子物质，生命活动主要依靠蛋白质来承担。获得大量的某种蛋白质往往是对其展开研究或应用的前提条件。在基因工程技术出现以前，从自然界原材料或组织中提取是获得蛋白质的主要途径，如从猪胰腺中提取胰岛素。但因为天然的蛋白质在细胞中的含量很低，因而纯化难度大，产量有限，导致产品价格高昂。现代基因工程技术的发展使得克隆并大量表达蛋白质成为可能。相对于天然提取，重组表达具有诸多优势，如：可利用质粒的多拷贝性或将目标基因置于强启动子下表达以提高蛋白质的表达水平；可对重组菌进行高密度培养，以提高目标蛋白质的产量；在构建表达载体时加入纯化标签以简化分离纯化步骤等。

蛋白质的表达系统已发展出真核表达系统和原核表达系统两大类。常用的真核表达系统包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等；常用的原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等。其中，大肠杆菌表达系统是发展最早、应用最广泛的表达系统。作为一种简单的原核生物，大肠杆菌具有遗传背景清晰、生长快速、基因操作简便、易于高密度发酵等显著优点，使其成为重组蛋白表达的首选。

大肠杆菌为革兰氏阴性菌，其细胞具有内外两层细胞膜，因而重组蛋白的表达在大肠杆菌中可定位于三个区域：胞内(细胞内膜包裹的空间)、周质空间(细胞内膜和细胞外膜之间区域)及胞外。通常将定位于胞内的表达称为胞内表达，定位于周质空间和胞外的统称为分泌表达。但除了一些特殊蛋白质如毒素和溶血素之外，大肠杆菌通常不将蛋白质分泌到胞外，因而在大肠杆菌中的分泌表达一般是指将蛋白质分泌至周质空间。

胞内表达具有表达水平高、表达载体构建容易等优点，但也有一些缺点，主要表现在：(1)蛋白质在胞内大量表达时容易形成不可溶的聚集体即包涵体，而从包涵体中回收活性蛋白质非常困难；(2)胞内有较多的蛋白酶，而蛋白酶可能会降解表达的目标蛋白；(3)胞内为强还原性环境且缺乏促进二硫键形成的酶，这对于一些含有二硫键结构的蛋白质的表达是不利的。相比较之下，分泌表达在某些方面具有优势：分泌产物的N端氨基酸残基与经过特定信号肽酶切除掉信号肽之后的自然基因产物的N端序列相同；周质空间的蛋白酶种类及活性比在细胞质中的少且活性低，可以避免或减少目标蛋白的降解；周质空间高的氧化还原环境和催化二硫键形成的酶的存在有利于二硫键的正确形成；除此之外，相对与大肠杆菌胞内4000多种蛋白而言，周质空间中100余种蛋白的存在大大降低了后续的分离纯化的难度。

跨内膜转运是重组蛋白分泌表达的重要前提，而跨内膜转运依赖于信号肽的引导。大肠杆菌胞内蛋白质的分泌主要通过三种途径：依赖于SecB的途径、信号肽识别颗粒(SRP)和双精氨酸转运途径(Tat)，其中依赖SecB的途径为绝大多数的分泌蛋白转运出内膜的途径,依赖于SecB途径转运的分泌蛋白氨基端一般都带信号肽。

信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由10～40个氨基酸组成，按其结构划分，可分为三个区域：N末端、中间序列和C末端。N末端带正电荷，富含碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸；中间序列富含疏水氨基酸，能够形成一段α螺旋结构，是信号肽的主要功能区；C末端带负电荷，富含小分子氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸，是信号肽序列的切割位点，也称加工区。信号肽利用N端的正电荷和中间区域的疏水性以静电作用和疏水作用与转运关键蛋白相互作用，它们对于蛋白质的跨膜转运是必不可少的。在将蛋白质转运跨越细胞内膜时，信号肽被特定的信号肽酶切割以得到成熟的蛋白产物。