[发明专利]肺癌多基因变异文库构建方法

说明书

本发明涉及一种肺癌多基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据肺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.计算得到各引物对的判断参数R，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液进行文库PCR扩增，得到测序文库。本发明的肺癌多基因变异文库构建方法所构建的文库测序通量高，灵敏度强，特异性强，能够用于检测游离DNA低频突变的。

技术领域

本发明涉及一种肺癌多基因变异文库构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。

新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion Torrent^TM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究核医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的告诉发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用，某些疾病的易感基因通常只占基因组很小的一部分，对这些易感基因的研究并不需要对全基因组测序，而只需要对特定的几个基因进行研究，目标序列捕获测序的出现，使得对基因组塔顶区域的研究成为可能。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。

SNPs(单核苷酸多态性)指在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一直，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类DNA中常见的变异形式，数以百万存在整个人类的基因组中，部分SNP能够导致蛋白质氨基酸编码改变或基因表达调控改变。拷贝数变异(CNV，Copy number variations)指在人类基因组中广泛存在的，从1Kbp到数百万bp范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异。SNPs和CNVs是人类表型变异的两个重要潜在来源，都是与基因组参考序列比对，与基因表达形状各有不同程度的显著相关。对SNPs的关联研究目前较多，许多CNVs位于基因结构变异的复杂区域，一些CNVs与邻近的SNPs存在连锁不平衡，可通过检验SNPs基因型推测邻近的CNVs。理想的是每个样本DNA能用一个整合的分析同时检测SNPs和CNVs，扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，肺癌的发病率在多数国家呈明显上升趋势,且逐年不断增高,是世界各地最常见癌的一种,其发病率及死亡率占各种恶性肿瘤的首位。因此研究和发现与肺癌发生、发展相关的因子对于肺癌的早期发现、早期诊断及治疗方案的拟定和预后的判断具有重要的意义。

目前，对于肺癌基因检测的诊断方法多数停留在单个基因或者几个位点的检测水平，检测方法多为荧光PCR、芯片法等，但这种方法存在不同的缺陷，如操作复杂，引物或探针设计复杂、结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多，检测灵敏度低、联合基因数目较少、通量低等，不能满足临床多样本多位点筛查、诊断和检测的实际需求，从而使肿瘤患者错失了最佳的治疗时期。而且多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。