[发明专利]喷司他丁和阿糖腺苷生物合成基因簇及其应用

说明书

本发明涉及由抗生链霉菌产生的治疗淋巴细胞白血病天然产物喷司他丁和抗孢疹病毒、水痘病毒天然产物阿糖腺苷的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。两个化合物的生物合成基因包含在同一个基因簇中且相互独立。整个基因簇共包含10个基因：3个与喷司他丁合成相关的基因；5个与阿糖腺苷合成相关的基因；2个与两者转运调节相关的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断或提高喷司他丁和阿糖腺苷的生物合成。本发明所提供的基因及其蛋白可用于该化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

技术领域

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及核苷类抗生素喷司他丁(Pentostatin，PTN)和阿糖腺苷(arabinofuranosyladenine,Ara-A)的生物合成基因簇的克隆，序列分析，基因体内功能验证，体外生化研究及其应用。

背景技术

1967年，科学家首次从抗生链霉菌NRRL 3238(S.antibioticus NRRL 3238)的发酵液中分离出嘌呤类核苷抗生素阿糖腺苷(Biochemistry,1972,11,911-916)。阿糖腺苷具有广泛的抗DNA病毒活性，并已经应用于单纯孢疹脑炎、新生儿孢疹、带状孢疹和慢性髓细胞性白血病的治疗中(Biochemistry,1972,11,911-916；Trends Pharmacol Sci,2010,31,255-265)。由于阿糖腺苷极易于被细胞中广泛存在的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)作用转化形成阿糖肌苷(arabinofuransylhypoxanthine,Ara-I)，前期研究者同样从抗生链霉菌NRRL 3238的发酵液中分离得到了腺苷脱氨酶的强有效抑制剂喷司他丁(pentastatin,PTN)。同样作为嘌呤类核苷抗生素，喷司他丁在临床上应用于急性T细胞型淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤T淋巴细胞瘤和多毛细胞白血病的治疗(JAntibiot(Tokyo),1992,45,1914-1918)。

从化学结构上来看，阿糖腺苷作为腺苷的结构类似物，与腺苷在结构上的区别在于在C-2’位上的羟基发生立体异构；喷司他丁则含有一个特殊的1,3-二氮杂七元环。在前期报道中，通过同位素喂养实验，表明阿糖腺苷的生物合成途径中涉及到的C-2’的羟基异构化是由于C-2’和C-3’位的羟基发生交换而形成的(Arch Biochem Biophys,1989,270,374-382)。同样通过同位素标记实验，确定了喷司他丁的生物合成是以腺苷为前体，通过D-核糖的C-1插入嘌呤环的C-6位和N-1位形成了特殊的1,3-二氮杂七元环(Biochemistry,1984,23,904-907；Biochemistry,1987,26,5636-5641)；此外，也推测了喷司他丁生物合成的起始阶段与L-组氨酸的生物合成途径具有一定的相似性(Biochemistry,1988,27,5790-5795)。尽管阿糖腺苷和喷司他丁在临床上已得到广泛应用以及在化学合成方面的也有很好的研究进展，但是在过去数十年间，关于这两个嘌呤类核苷抗生素的生物合成仍然知之甚少。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明以一种抗生链霉菌(S.antibioticusNRRL 3238)产生的具有抗DNA病毒的天然产物嘌呤类核苷抗生素喷司他丁和阿糖腺苷为目标分子，对其生物合成基因簇进行克隆，通过序列分析、功能验证、体外生化实验，揭示了一个基因簇包含两个独立的生物合成途径的现象。本发明中整个基因簇是包含10个基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1中第20237-28760位所示，其中负责喷司他丁生物合成的基因，即penA，penB，penC共3个基因；负责阿糖腺苷生物合成的基因，即penD，penG，penH，penI，penJ共5个基因；负责喷司他丁和阿糖腺苷转运和调控的基因penE，penF共2个基因。

本发明还提供了一个编码ATP磷酸核糖转移酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，命名为penA，其核苷序列位于SEQ ID NO.1中第26377-27285碱基处。