[发明专利]人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用

说明书

本发明涉及人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用。本发明人应用毕赤酵母表达系统制备获得人乳头瘤病毒的病毒样颗粒，在此基础上制备四价的人乳头瘤病毒疫苗，所述的疫苗具有良好的免疫原性。

技术领域

本发明属于生物技术、重组新型疫苗领域，涉及人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用。

背景技术

宫颈癌在世界范围内是排名第三的女性易发癌症，世界卫生组织曾公布全世界每年有超过47万新发宫颈癌病例，其中中国约占28％，且发病率有低龄化趋势。宫颈癌严重威胁我国各年龄段女性，尤其是育龄女性的生命健康，我国亟需有效的宫颈癌预防、筛查、治疗措施和体系。

然而，宫颈癌又是当前唯一病因明确的恶性肿瘤。多年的研究表明高危型人乳头瘤病毒的持续性感染与宫颈癌的发生密切相关，90％以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。

HPV属于Papillomaviridae病毒科，是一类无包膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径在50nm左右。依据病毒结构蛋白L1的序列差异性进行分类，可将HPV分为130余种基因型。不同型的HPV病毒有着严格的组织感染特异性及致病性，感染生殖道黏膜组织的HPV依据致病性不同分为黏膜高危型和黏膜低危型两类。临床上常见的黏膜高危型HPV有16、18、31、33、45、52、58等型，这些基因型HPV的持续性感染可诱发宫颈组织发生病理性增生及病变，组织细胞发生转化，最终发展为宫颈癌，其中16、18两型病毒的感染与90％以上的宫颈癌发生相关。黏膜低危型HPV的感染可在生殖道中形成生殖器疣或引发局部炎症反应，间接促进高危型HPV的感染，黏膜低危型HPV包括6、11、13、32、34等型。

因此，预防和控制高危型HPV病毒的持续性感染是预防宫颈癌发生的重要手段。超过半数的人在一生中被侵染黏膜的HPV病毒感染过，由于个人遗传因素、机体状态、感染环境等因素的不同，一部分HPV感染为一过性的，很快被机体清除，而另一部分感染可能发展为持续性的慢性感染。实验证明，针对某一基因型的中和抗体可有效防止该型病毒侵染细胞，因此能够激活体液免疫并产生中和保护抗体的特异性HPV疫苗可有效预防特定HPV感染，从而有效降低宫颈癌发生的风险。

原核表达产生的L1蛋白有错误折叠倾向，需要在纯化后进行变复性操作，才能获得病毒样颗粒，操作条件复杂、难控制。目前国内外已有使用毕赤酵母研发HPV病毒样颗粒疫苗的报道，但还未有基于毕赤酵母研制四价疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供毕赤酵母来源的人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒多价疫苗的表达、纯化、免疫保护性检测及其应用等相关技术

在本发明的第一方面，提供一种制备人乳头瘤病毒的四价疫苗的方法，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述的表达载体分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列(较佳地形成4种重组表达载体)，能表达所述DNA序列所编码的蛋白；

(2)将步骤(1)的表达载体转入毕赤酵母中，进行表达，获得人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒；

(3)混合步骤(2)获得的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒，获得人乳头瘤病毒的四价疫苗。

在一个优选例中，所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列包含于表达盒中，也即它们分别与启动子以及终止子等表达元件操作性连接。

在另一优选例中，步骤(1)中，以pPink-HC为表达载体。