[发明专利]嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法

说明书

本发明涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物、以及使用该引物组合物的嵌合体检测方法。本发明所涉及的嵌合体多重PCR引物组合物包括：一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物由选自表格(I)或表格(II)中的识别引物对1～48或49～96中的任意25对以上的识别引物对组成。在本发明中，通过使用这样的25对以上的识别引物对进行多重PCR，对供体、受体及嵌合体的DNA样本进行二代基因测序分析，筛选出多个SNP差异性位点并计算嵌合率；在此基础上，再通过表(II)中的标签引物样本识别技术对样本污染问题进行控制，由此能够显著地提高检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法。

背景技术

骨髓移植是许多血液系统疾病和免疫缺陷性疾病的有效治疗措施，移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入状况即嵌合状态的形成有关。如果受者的骨髓或外周血中完全是供者的细胞，则形成完全的供者嵌合状态(CC)；如果检测到供者和受者为两种细胞成分时，则形成混合嵌合状态(MC)。在骨髓移植中，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前许多恶性血液病和一些非恶性疾病的主要治疗手段。在allo-HSCT中，移植后区分造血细胞是来源于供者还是受者很重要，对于判断是否植入、疾病复发以及干预性免疫治疗等具有临床指导意义。

正是基于造血细胞的供者或受者的来源区分以及可能的嵌合状态的重要性，近年来针对嵌合状态的检测方法得到了明显的发展。比较流行的检测方法主要根据例如红细胞抗原、细胞遗传学(染色体核型)、HLA、限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复(STR，又称为微卫星)、以及其他特殊的具有多态性的DNA分子等人群中所具有的多态性遗传标记。

在这些方法当中，目前应用最广泛的是检测灵敏度(以下，有时也称“灵敏度”)比较高的PCR法扩增微卫星序列。微卫星序列是分布于整个基因组上的呈高度多态性的串联重复序列，扩增这些区域可以区分供者或受者来源的细胞，临床上主要应用于异基因移植背景下的供体细胞嵌合率的检测。此外，为了改善检测灵敏度，也有利用短串连重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)等进行嵌合体的检测。

然而，现有所采用的PCR法的检测灵敏度例如仅达到1～5％，并且其灵敏度根据检测对象的不同而波动较大。例如，目前临床上所采用SNP识别与STR微卫星的PCR法进行嵌合体检测的方法，其检测水平仅能达到1～5％，检测灵敏度相对较低。

发明内容

本发明有鉴于上述现有的状况，其目的在于提供一种能够明显提高检测灵敏度的嵌合体多重PCR引物组合物和检测方法。

为此，本发明的第一方面涉及一种嵌合体多重PCR引物组合物，其包括一组以上的多重PCR引物，并且各组多重PCR引物由选自表1中的识别引物对1～48中的任意25对以上的识别引物对组成。

表1多重PCR引物组合物中的识别引物对

在本发明中，通过使用这样嵌合体多重PCR引物组合物，特别是经过大量SNP位点的平行检测，能够明显地提高嵌合体的检测灵敏度(例如0.1％-0.5％)。这里，“检测灵敏度”或“灵敏度”是指PCR检测灵敏度或PCR灵敏度的简称。