[发明专利]一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法

权利要求书

1.一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于，由以下步骤组成：选取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的单独培养组，设置三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC的共培养组；所述的共培养组采用小室上下室共培养，上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞；在单独培养组和共培养组的细胞培养皿中添加10ng/ml TGF-β刺激36h后，收集两组细胞上清，加入缓冲液，漩涡震荡60min，-20℃保存，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE1因子在共培养组和单独培养组的分泌结果，其中三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC的共培养组中SERPINE1因子分泌升高，促进三阴性乳腺癌细胞的转移。

2.根据权利要求1所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于，所述应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组细胞上清中分泌蛋白的差异表达的具体步骤为：样品处理；强阳离子交换色谱分离样品；C18反相色谱除盐，进行肽段的纯化；质谱检测；其中所述的样品处理具体步骤为：

(a)上清加入DTT至终浓度10mM；56度水浴1h；取出后，迅速加入IAM至终浓度55mM，暗室静置1h；

(b)加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20℃沉淀3h以上，离心20min，取沉淀；加入300μl的复溶缓冲液，超声3min助溶；

(c)使用bradford法对蛋白进行定量，每个样品取100μg蛋白体积，用含0.1%SDS的TEAB补齐所有样品体积；

(d)加入1μg/μl的Trypsin，每100μg蛋白质底物加入3.3μg的酶，37℃水浴24h，然后补加Trypsin 1μg，37℃水浴12h；

(e) 冻干消化液，然后使用每管30ul TEAB的复溶肽段，TEAB的组成为水：TEAB=1:1，含0.1%SDS，取1μl消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。