[发明专利]一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是人体皮肤和鼻腔常见的定植菌，既可引起局部化脓性感染，也可引起全身性感染。它不仅是重要的临床与社区获得性致病菌，也是人类第二大食源性致病菌。

金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白（PSMs）是Wang等人在2007年用热苯酚从高致病性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的培养液中提取的七种新的小肽。PSMs基因定位于细菌核心基因组，是典型的α-helix结构，表现出似于表面活性剂的两亲性质。其表达受到Agr系统的严格调控，通过不依赖于RNAIII的新途径在对数生长后期大量表达，并通过金黄色葡萄球菌表面特有的Pmt通道向胞外分泌。PSMs按照肽段大小和基因组定位可分为α型与β型，其中α型包括定位于PSMα操纵子的PSMα1-4，以及定位于附属基因调控系统关键调控分子RNAIII基因内的δ毒素；β型包括定位于PSMβ操纵子的PSMβ1和PSMβ2。

研究表明，低浓度的PSMs可导致免疫细胞趋化与炎症反应，高浓度的PSMs则能溶解许多人类细胞，可破坏中性粒细胞、树突细胞等免疫细胞、红细胞等血细胞以及白细胞。此外，PSMs能够促进生物被膜的形成，有利于细菌对抗抗生素与宿主的免疫防御机制。同时，PSMs有一定的抑菌活性，它可能是金黄色葡萄球菌获得环境竞争优势的关键分子，帮助其在特定环境如食品、皮肤、鼻腔中定植发挥重要作用。因此，建立食品中金黄色葡萄球菌的新毒力因子PSMs的定性定量分析方法，有利于研究其致病机制，具有重要的实际意义。

目前，国内外关于金黄色葡萄球菌PSMs的检测方法研究较少，仅有质谱成像技术和液相-离子阱/三重四极杆质谱法。前者前处理要求较高，操作较为繁琐，且主要用于定性分析。后者分辨率较低，质荷比仅可精确到1Da，无法将质荷比极为接近的干扰物分离，且两种方法都只做了培养液中金黄色葡萄球菌PSMs，并没有应用到实际样品测定中。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是建立一种食品中金黄色葡萄球菌PSMs的分析方法，从而为PSMs的致病机制研究提供一个新途径。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

1、菌株接种

将保存在甘油中的金黄色葡萄球菌与TSB培养液以1:100（V/V）均匀混合，振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100 µL，加至2 g肉、蔬菜、牛奶或果汁中。

2、样品提取

用正丁醇提取PSMs，振荡2 h（37℃，200 rpm），转移有机相至空白管，常温下氮气吹干，超纯水复溶，用孔径为0.22 µm的滤膜过滤。

3、液质分析

（1）色谱条件

色谱柱：Zorbax 300Å SB-C₈ (3.5 µm, 2.1×150 mm, Agilent) ；

流动相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：乙腈；

梯度程序：0-2.5 min，10%B; 2.5-5 min, 50%B;5-20 min, 50%B-90%B；

进样量：5 µL；

柱温：30℃。

（2）质谱条件

离子化模式：Dual AJS ESI （+）；

质量扫描范围：100-3200 m/z；

毛细管出口电压：175 V；

干燥器温度：325℃，干燥器流速：10 L/min；

鞘气温度：350℃，流速：7.5 L/min；

毛细管电压：4000 V；

碰撞电压：PSMα1(60 V)，PSMα2(55 V)，PSMα3(65 V)，PSMα4(65 V)， δ-toxin(65 V)。

4、PSMs的定性定量离子质荷比

PSMs的定性定量离子质荷比如表1所示。其中d表示目标离子电荷数为2，t表示目标离子电荷数为3。

本发明技术效果主要体现在以下方面：飞行时间质谱是高分辨率质谱，质量精度可达到小数点后第四位，一方面，可以得到目标物的精确质量，另一方面，对目标离子进行二级质谱扫描，得到碎片信息及图谱，结合Mascot在线搜索，即可知道目标物的氨基酸序列。同时，在合成多肽的基础上，建立食品中PSMs的定量分析方法，在复杂的食品基质中，飞行时间质谱的高分辨率可以将杂质与目标物完全分离，且样品前处理较为简单。

附图说明