[发明专利]一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL‑2和IL‑6表达的相关性分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，具体地说，涉及一种自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法。

背景技术

高血压作为多因素引起的慢性疾病，其病因和发病机制十分复杂。ARIMA等研究发现，高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病均与机体免疫系统功能关系密切。免疫系统，尤其外周血T细胞、B细胞及自然杀伤细胞中均表达连接蛋白(connexin,Cx)。Cx是缝隙连接的基本组成单位，在相邻细胞间传递信息物质，构成缝隙连接细胞间通讯。MATSUE等研究发现，在脂多糖和肿瘤坏死因子ɑ刺激下，单核细胞中Cx43表达可显著上调。因此，缝隙连接与机体免疫炎性反应相关，参与免疫系统细胞间通讯。CD4+T细胞和CD8+T细胞作为外周血T细胞的主要亚群细胞，参与调节机体免疫炎性反应，在抗感染、抗肿瘤方面发挥重要的免疫调节作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，初步探讨Cx43与高血压大鼠炎性反应间的关系，为阐明Cx43对高血压患者炎性反应的作用机制提供理论依据。

其具体技术方案为：

一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，包括以下步骤：

步骤1、大鼠血压测定 应用BP-6无创血压监测仪测量大鼠尾动脉血压，避免大鼠躁动，于大鼠清醒安静状态下连续测量3次，每次间隔至少1min，取测量3次平均值即为大鼠收缩压。

步骤2、样本采集 3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主动脉外周血5ml，1 500r/min离心5min，取血浆于-20℃保存，离心后的下层血细胞用于分离外周血淋巴细胞。

步骤3、炎性因子IL-2和IL-6表达 取冻存于-20℃的血浆样品，ELISA法检测IL-2和IL-6表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

步骤4、淋巴细胞分离 将血细胞与0.9％氯化钠溶液1:1等体积稀释，吹打混匀。取无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢按照1:1比例加到淋巴细胞分离液上层，保证血液置于淋巴细胞分离液上层。根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机水平离心30min(1 500r/min，缓升缓降)。将分离的白色浑浊淋巴细胞层吸出至无菌15ml离心管内，加入3倍0.9％氯化钠溶液洗涤，以1 800r/min离心6min洗涤2次，弃上清，沉淀即淋巴细胞。加入1ml培养基重悬，吸取50μl到1.5ml离心管，加450μl磷酸盐缓冲液(PBS)稀释10倍，显微镜下计数并用台盼蓝染色观察细胞活性。细胞活性为95％以上，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，将细胞接种在24孔板中。

步骤5、流式细胞术检测CD₄⁺和CD₈⁺T细胞Cx43表达 收集5×10⁵个细胞于EP管内，100μl PBS重悬细胞，分别加入相应流式抗体(CD₄-APC，APC同型对照；CD₈-PE，PE同型对照)1μl，并设立阴性对照。125μl固定剂固定淋巴细胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗体与99μl 1×破膜剂破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜剂洗涤，弃上清液，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，流式CELLQuest软件进行分析。

步骤6、实时荧光定量PCR检测IL-2mRNA和IL-6mRNA表达 计数分离出的淋巴细胞，调整培养基至细胞浓度为1×10⁶个/ml。将淋巴细胞分为空白对照组、刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)组(培养48h后加入5μg/ml ConA)和Gap27+ConA组(培养前加入5 00μmol/L Gap275，培养48h后加入5μg/ml ConA)。加入10％自体血清(血清处理步骤：56℃灭活30min，以4 000r/min离心30min，4℃保存)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。