[发明专利]高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度

权利要求书

1.一种采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)获得多份不同已知浓度的金黄色葡萄球菌溶液；

2)确定金黄色葡萄球菌与高效液相色谱方法的依从关系；

2.1)确定高效液相色谱条件：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：由体积比为10～20∶90～80的A液和B液组成，其中A液为乙腈，B液为0.03～0.07％体积的磷酸水溶液，洗脱时为等度洗脱；

检测波长：205～235nm；

2.2)确定金黄色葡萄球菌与2，5-二羟基苯甲酸在高效液相色谱仪上响应值的依从关系：

将步骤1)获得的各份金黄色葡萄球菌溶液调配成浓度大于5×10⁴cfu/mL的菌液，然后分别向各份菌液中按同样的比例加入营养液，培养2～4h，得到培养后菌液；所述的营养液由水杨酸与葡萄糖或果糖用无菌水配制而成，其中水杨酸的浓度为1×10^-4～9×10^-4mol/L，葡萄糖或果糖的浓度为1×10^-3～9×10^-2mol/L；

采用高效液相色谱仪，按上述确定的色谱条件，将所得的各份培养后菌液逐一进样，记录每次进样时高效液相色谱仪上响应的2，5-二羟基苯甲酸的浓度值，根据全部进样的金黄色葡萄球菌浓度和与其对应2，5-二羟基苯甲酸的响应浓度值作曲线，得到2，5-二羟基苯甲酸浓度-金黄色葡萄球菌浓度曲线，该曲线为一直线，确定金黄色葡萄球菌与2，5-二羟基苯甲酸在高效液相色谱仪上的响应浓度的依从关系为线性关系；

3)金黄色葡萄球菌浓度的快速检测

3.1)按步骤2)中的检测条件，将待测水体样品进样，记录高效液相色谱仪上响应的2，5-二羟基苯甲酸浓度值；

3.2)利用步骤2.2)确定的2，5-二羟基苯甲酸浓度-金黄色葡萄球菌浓度曲线，结合上述步骤3.1)记录的浓度值读出该浓度值对应的金黄色葡萄球菌浓度，该浓度即为待测水体的金黄色葡萄球菌浓度。

根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：步骤2.1)中，所述的高效液相色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：由体积比为15∶85的A液和B液组成，其中A液为乙腈，B液为0.03～0.07％体积的磷酸水溶液，洗脱时为等度洗脱；

检测波长：215～225nm。

根据权利要求2所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱条件中：

流动相的组成中，B液为0.05％体积的磷酸水溶液；

检测波长为220nm。

2.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：高效液相色谱仪上出现2，5-二羟基苯甲酸吸收峰的时间为5.99min。

3.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：步骤2.2)中，是将步骤1)获得的各份金黄色葡萄球菌溶液调配成浓度为5×10⁴～5×10¹⁰cfu/mL的菌液。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：步骤2.2)中，营养液的加入量按每100μL菌液加入8～15mL的营养液计算。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：步骤2.2)中，培养的时间为2.5～3h。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：步骤1)中，获得多份不同已知浓度的金黄色葡萄球菌溶液的具体操作为：金黄色葡萄球菌菌液用无菌水稀释，分多次取适量稀释液分别注入到多个培养瓶中，计算各培养瓶中金黄色葡萄球菌的菌落数，得到多份不同已知浓度的金黄色葡萄球菌溶液。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的采用高效液相色谱法快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌浓度的方法，其特征在于：所述的2，5-二羟基苯甲酸浓度-金黄色葡萄球菌浓度曲线用于拟合表达金黄色葡萄球菌浓度与2，5-二羟基苯甲酸在高效液相色谱仪上的响应浓度值的依从关系，拟合得到的公式为lgC＝kc+K，其中c为2，5-二羟基苯甲酸的浓度，单位为μmol/L，k为常数，K为常数，C为金黄色葡萄球菌的浓度，单位为cfu/mL。