[发明专利]双齿围沙蚕Gα重组蛋白、多克隆抗体及Gα蛋白ELISA检测方法

说明书

本发明公开一种双齿围沙蚕Gα重组蛋白、多克隆抗体及Gα蛋白ELISA检测方法，是通过Gα开放阅读框设计特异性引物并通过PCR获得目的片段，构建了双齿围沙蚕Gα蛋白的原核表达系统，获得了纯化的双齿围沙蚕Gα重组蛋白，制备了其多克隆抗体，并建立了双齿围沙蚕Gα蛋白的ELISA检测方法，可利用方法简单、特异性强的ELISA技术测定双齿围沙蚕在环境雌激素污染下Gα蛋白的变化情况，可为环境雌激素对双齿围沙蚕毒性效应的机制提供实验基础及依据。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种双齿围沙蚕Gα重组蛋白、多克隆抗体及Gα蛋白ELISA检测方法。

背景技术

G蛋白广泛存在于细胞膜上，并且参与胞内多种信号转导过程，在机体内发挥中重要的生理作用，激素、神经递质、气味、趋化因子等胞外信号首先刺激细胞膜上的相应的GPCRs，被激活的GPCRs再与G蛋白偶联，激活相应的细胞信号通路，产生相应的生物学效应。最新研究发现G蛋白及其偶联的雌激素受体介导了环境雌激素在生物体内的非基因组效应，这为利用G蛋白作为生物标志物进行环境雌激素效应的检测提供了可能性。双齿围沙蚕（P. aibuhitensis）隶属于环节动物门、多毛纲、沙蚕目，是一种栖息于潮间带地区沉积质中的底栖生物。与海洋鱼类不同，沙蚕作为一种底栖生物，其食腐殖质的食性和不易远距离迁徙的生活习性，使得该物种极易接触到环境污染物，国内部分学者已开始利用该生物作为生态监测指示生物进行相关研究。

酶联免疫法亦称ELISA法，是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，具有方法简单、特异性强等特点。然而，由于目前关于G蛋白体外表达的报道多集中在无脊椎动物昆虫的G蛋白表达或是病毒G蛋白的表达，而对于双齿围沙蚕Gα蛋白的体外诱导表达及多克隆抗体的制备还未见报道，以至于无法采用ELISA法深入研究双齿围沙蚕在环境雌激素污染下的分子水平转录机制。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种双齿围沙蚕Gα蛋白的多克隆抗体及Gα蛋白ELISA检测方法。

本发明的技术解决方案是：一种双齿围沙蚕Gα重组蛋白，其特征在于依次按照如下方法制备：

a. 提取双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；

b. 以双齿围沙蚕cDNA第一链为模板，进行PCR扩增反应，所述PCR反应的上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

c. 对扩增产物1061bp切胶回收，将回收目的片段与pMD18-T连接，构建克隆质粒pMD18-T-Gα，将克隆质粒pMD18-T-Gα切胶回收后转化到感受态细胞DH5α中，挑取单克隆；

d. 将单克隆转到5ml Amp 100μg/mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm 震荡过夜培养，抽提重组质粒pMD18-T-Gα；

e. 用限制性内切酶BamH I和Xho I分别消化重组质粒pMD18-T-Gα和质粒

pET-28a，并切胶回收Gα目的片段与质粒pET-28a，将回收的Gα目的片段与质粒pET-28a按照摩尔比2.25：1的比例，以T4 DNA连接酶，16℃连接14h；切胶回收重组质粒pET-28a-Gα后转化到感受态细胞DH5α中，挑取单克隆；

f. 将单克隆转到5ml Kan 100μg/mL LB液体培养基中，37℃200rpm 震荡过夜培养，抽提重组质粒pET-28a-Gα；