[发明专利]一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用

说明书

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用，该鸡尾酒式冷冻保护剂包括如下组分：多糖1％～60％(w/v)，氨基酸1％～50％(w/v)，多元醇1％～20％(v/v)，含羟基的高分子聚合物0％～10％(w/v)。本发明的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，高浓度时毒性也较低，利用该配比的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，可以有效抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率，大大较低了冻存细胞的毒性，因而本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂具有极高的安全可行性和应用推广价值。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用。

背景技术

人多功能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)包括人类胚胎干细胞及人诱导多功能干细胞，这类细胞的获取标志着生物医学研究领域的新纪元。人多功能干细胞具有自我更新的能力，同时可以分化为几乎所有类型的人类组织细胞。这些卓越的特性使得hPSCs在组织工程，再生医学及细胞移植领域具有广阔的应用前景，将有望产生一系列细胞疗法用于帕金森疾病、糖尿病、心血管等疾病的治疗。然而，hPSCs细胞经冷冻保存后较低的恢复率严重影响并阻碍了其在生物和医学领域的广泛应用。

细胞冷冻保存是将细胞培养物悬浮在含有冷冻保护剂的溶液中，以一定的速率降至零度以下，并在低温下长期保存的过程。细胞冷冻保存一般是保存在－80℃或液氮－196℃的低温环境中。在冷冻过程中，细胞会发生胞内外的结晶，同时细胞内外的溶液浓度也会由于结晶发生相应的改变，曝露在低温下的细胞也会随之产生不同的压力。

截至目前，有两项技术应用于hPSCs的冷冻保存应用中，一种是传统的慢速冷冻，另一种则是玻璃化冻存。在这两种方法中，DMSO(DMSO)是普遍采用的冷冻保护剂。客观来说，DMSO广泛应用于小鼠胚胎干细胞、人类造血干细胞、人间充质干细胞、人脂肪干细胞的冷冻保存中，并在这些细胞中取得了良好的冷冻效果，可是DMSO在hPSCs上的应用效果却并不理想，细胞经慢速冷冻保存的恢复率仅为5％～25％，同时会导致大量干细胞分化。

与此对比，利用开放式拉长细管将细胞置于高浓度冷冻保护剂中并快速插入液氮的玻璃化冻存则可获得较高的细胞存活率(25％～75％)，但这项技术并不适合广泛应用。一是由于开放式拉长细管仅能容纳10～100ul的细胞悬浮液，同时操作需手动进行，并不适合大批量的hPSCs冷冻保存，再就是高浓度的冷冻保护剂在4℃以上毒性较大，尤其是在体温环境下会引起机体较大毒性反应，例如细胞中残留的DMSO会引起血管内溶血、高渗，并增加血清转氨酶水平。这些发现大大降低了经冷冻保存复苏后多功能干细胞生物利用的可靠性，因而发展高效低毒的人多功能干细胞冷冻保护剂迫在眉睫。DMSO联合海藻糖、乙二醇、羟乙基淀粉使用可有限度地提升冷冻保存效果，但仍无法满足要求。因此，寻求及发展有效的生物相容性冷冻保护剂体系并优化其配比是本领域亟需解决的技术难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

说明：本发明中所述的w/v，其单位均为kg/l或mg/ml；本发明中所述的v/v，其单位均为l/l或ml/ml。

本发明的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物具有良好的生物相容性，高浓度时毒性也较低，利用所述配比的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，可以最大限度地抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，因而大大较低了冻存细胞的毒性，并提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率。本发明通过所述简单的组合配比即能够发挥多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物等每种冷冻保护剂的最大保护优势，同时在冷冻细胞程序上并无增加。由所述组分所制备的冷冻保护剂呈现如鸡尾酒式的分层，这也是本发明名称的由来。

本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂优选包括如下组分：