[发明专利]适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物及其使用方法

说明书

本发明适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，含有4种维生素、2种氨基酸、2种细胞因子、3种蛋白、3种金属离子、4种激素、2种脂肪酸、4种抗氧化剂和其他物质；所述替代血清组合物的使用方法为：⑴配制含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基；⑵准备培养介质；⑶含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用；⑷体外培养的肝样细胞的传代或收获。本发明提供了组分明确、可添加到DMEM/F12基础培养基中适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物；其使用方法操作步骤简单明确，利于肝样细胞体外无血清培养和扩增；能为肝样细胞在药物研究和临床治疗中的应用提供积极支持，具有良好的社会和经济效益。

技术领域

本发明涉及现代生物技术之培养基技术领域，涉及动物细胞培养的无血清培养基，具体地说，是一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物及其使用方法。

技术背景

肝脏是人体内最大的器官，也是体内少有的具有再生能力的器官。肝脏承担着机体内重要的生理活动，具有糖原合成和分解、储藏维生素A、尿素合成、药物代谢和解毒等功能，对人体的新陈代谢具有至关重要的作用。肝细胞作为肝脏功能的主要行使者被广泛应用于基础研究和临床研究，现今的药物开发和研究以及肝细胞移植都需要大量具功能的肝细胞。但是，目前的肝细胞主要取自供体肝脏，来源非常有限。而通过体外增殖获得肝细胞不仅困难而且其肝功能会急剧下降。因此，本领域迫切需要拓展新的肝细胞的来源，以满足基础研究和临床应用的需求。

现有的研究表明：成纤维细胞在一定条件下可以转分化为特定的细胞类型。如果能够将来源于病人的成纤维细胞转分化为肝细胞或者是具有肝功能的细胞，不但可以解决肝细胞来源的问题，而且可以在细胞移植或者生物人工肝应用过程中避免潜在的免疫排斥等问题。目前，有研究机构通过限定转录因子诱导成纤维细胞向肝样细胞的直接转化，成功地将成纤维细胞诱导为具肝样功能的细胞，并通过SV40 Large T过表达，促进肝样细胞的增殖。

由转分化获得的肝样细胞具有与原代肝细胞类似的表型及功能，如分泌白蛋白、合成尿素、储存糖原、部分药物代谢和转运能力等，并且在体外可以长期稳定增殖和维持功能。现已证实，经过细胞移植，肝样细胞在生物体内不但具有再生能力并且不存在潜在的致瘤风险。这些研究均表明：肝样细胞有望代替原代肝细胞用于肝脏药物研究和临床应用。然而，在药物研究和临床应用中需要大量的功能肝细胞，如临床上为肝衰竭成人患者提供肝功能支持的生物人工肝系统常需要10¹⁰-10¹¹功能肝细胞，而通过转分化通常只能获得10⁶-10⁷功能肝细胞；因此，需要在体外大量培养和扩增肝样细胞。

在体外培养动物细胞的过程中，培养基是细胞营养物质的唯一来源，因此，培养基的成分直接影响动物细胞的增殖和功能。由于不同动物细胞的代谢特性不同，它们对营养物质的需求也不同，故需要根据动物细胞的特性设计不同的、有特征的个性化培养基。目前，市场上有一些商业化的基础培养基可用于肝细胞的培养，例如：DMEM/F12和William E等，其中，William E培养基主要用于原代肝细胞的培养，而DMEM/F12培养基主要用于由ESC、iPSC等分化而来的肝样细胞的培养。这两种所述的基础培养基均具有一定的普适性，可用于许多种类细胞的培养，但培养基中必需添加动物来源的血清和其他添加剂。

血清是一种复杂的混合物，其中含有多种细胞粘附、生长和增殖所需的生长调节因子，能够补充基础培养基中没有或者量不足的营养成分，提供载体蛋白以结合维生素、脂质和金属离子等，还能提供蛋白酶抑制剂等。但是，由于血清来源于异种动物，成分不明，不同批次的血清差异较大，质量难以控制，且存在病毒感染、免疫排斥等风险，因此，采用含血清培养基培养的动物细胞在药物研究和临床应用上往往存在较大的限制。要实现肝样细胞在药物研究和临床治疗中的可靠或安全应用，在其体外培养过程中不能添加动物来源的血清。然而，作为由成纤维细胞转分化而来的肝样细胞是一种全新来源的细胞，目前还没有能支持其体外扩增和维持其功能的无血清培养基。