[发明专利]一种适配体组合文库、其构建方法及用途

说明书

本发明提供提供一种构建适配体组合文库的方法、基于上述构建适配体组合文库的方法构建的适配体组合文库、通过所构建的适配体组合文库筛选适配体的方法、以及通过上述筛选方法筛选获得的适配体。本发明提供的构建适配体组合文库的方法，采用高效的结构剪裁方式构建内含较少序列的组合文库，所构建的适配体组合文库涵盖了能产生特异亲和作用的大多数可能范围。本发明筛选得到亲和力更优、无冗余序列的最短适配体活性序列。

技术领域

本发明涉及分子生物学、分析化学以及组合化学领域。具体而言，本发明涉及适配体组合文库及其构建方法，还涉及使用所述的适配体组合文库筛选评价所需适配体的方法以及由该方法筛选得到的适配体。本发明还涉及所述筛选得到的适配体的用途及含有所述筛选得到的适配体的试剂盒。利用本发明提供的适配体组合文库及筛选方法筛选得到的适配体亲和力更优，并且无冗余序列。

背景技术

寡核苷酸适配体(Oligonucleotide aptamer)，通常经指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到(Nature 1990,346；Science 1990,249(4968):505-510)，一般为一段短的单链寡核苷酸序列(ssDNA或RNA)，通过折叠成一定的三维结构，经空间构型互补与靶分子形成高亲和力、高特异性结合，又称为“化学抗体”(Oncotarget 2016,7(12):13446-13463)。

对于通过SELEX技术筛选得到的适配体又称全长适配体，一般均包含引物序列和随机序列，长度一般在70～130碱基(nt)之间。全长适配体和靶分子的关键结合位点一般并不明确，这导致了全长适配体不适合作为功能性识别元件。许多经SELEX技术筛选出的适配体，其引物区与随机区产生碱基配对，某些引物区参与了特异性识别，或者随机区序列较长，存在冗余碱基序列。因此，对于全长适配体序列，需对其进行结构剪裁，以便于得到既保持结合活性、又仅有适当长度(10-40nt)的适配体，这样的适配体更适合作为功能性识别元件。为了得到这样的适配体，需要精确界定对识别功能产生贡献的适配体序列(或结构域)。

因此，适配体后筛选(post-SELEX)始终是研究热点之一，已发展了结构剪裁、化学修饰、多价组合、定点突变等方法，从中寻找亲和性更高、特异性更强、序列更短的适配体，但多数尚限于以试错法(J.Biol.Chem.2001,276(54):48644-48654)进行尝试。

试错法一般是针对末轮文库的富集序列，在共有的二级结构及计算所得较低自由能(ΔG)的基础上，依据一些核酸二级结构的经验性判断，对适配体序列进行较为随机的剪裁或定点突变，例如，上官等采用试错法，对其筛选得到的呈环1-茎1-环2-茎2-环3二级结构的肺癌细胞适配体Sgc8，进行结构剪裁，逐级截掉环1、茎1、环2等，最终得到茎2-环3的适配体序列Sgc8c，基本保留了原Sgc8的亲和力(Chem.Bio.Chem.2007,8:603-606)。又例如，发明人之前针对重组人促红细胞生成素-α筛选得到的全 长适配体828，经截掉全部随机序列后得到的828r，较原来828的亲和力稍优(CN102191250A；Bioorg.Med.Chem.2010，18，8016-8025)。