[发明专利]一种人正常角膜上皮细胞及其用途

权利要求书

1.一种人正常角膜上皮细胞，其特征在于，分类命名为人正常角膜上皮细胞HNCEC/HL-008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201550；所述人正常角膜上皮细胞原代分离培养自人的正常角膜组织，所述人正常角膜上皮细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞；所述人正常角膜上皮细胞在显微镜下观察到的形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞，所述上皮细胞形态在培养65天仍处于增殖状态正常生长，所述上皮细胞在三维的培养条件下具有正常的分化功能，在体外无异常增殖和致瘤性，所述人正常角膜上皮细胞的原代分离培养包括以下步骤：

在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集胬肉患者手术切除的胬肉旁正常角膜缘组织样品；

用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS洗2次，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；

将组织样品用消化液消化，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL培养基，所述HL培养基为按体积比为1:3的比例混合的DMEM与无血清培养基，同时还添加5％(v/v)的FBS，0.4μg/mL皮质醇，5μg/mL胰岛素，8.4ng/mL霍乱毒素，10ng/mL表皮生长因子，24μg/mL腺嘌呤，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL两性霉素B以及30μM法舒地尔；

消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于质量体积比为0.25％的胰酶-EDTA中消化；

加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；

加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；

再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；

重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常角膜上皮细胞；

所述人正常角膜上皮细胞的传代培养方法包括以下步骤：

当人正常角膜上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS洗涤细胞，再用质量体积比为0.05％的胰酶-EDTA消化单层细胞；加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。

2.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在人正常细胞的生理学研究中的应用。

3.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在体外正常细胞的药物毒性研究和检测中的应用。

4.权利要求1所述的人正常角膜上皮细胞在角膜和角膜相关疾病的发病机理研究中的应用。