[发明专利]DNA片断与载体快速连接转化的新方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基因克隆技术，即对传统的分子克隆技术进行了改良，具体地说是运用PCR扩增技术替代常规的连接酶反应步骤，将待克隆的DNA片断与载体快速连接并直接转化到大肠杆菌感受态细胞的实验方法。与传统方法相比，该技术不受限制性内切酶酶切位点限制，根据DNA片段和载体末端序列设计接头引物，利用PCR反应可将任何DNA片段与载体连接起来，实现分子克隆的目的。该方法作为一种通用方法,不仅缩短了分子克隆反应时间，提高了克隆转化效率，而且适用于不同长度基因与载体的连接及转化，具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说涉及一种基因克隆改良技术，即采用PCR扩增方法替代传统的DNA连接酶反应步骤，将待克隆的DNA片段和线性载体作为PCR反应模板，利用待克隆的DNA片断和线性载体两端接头引物，通过PCR扩增反应，将DNA片断与线性载体连接起来，并将PCR产物直接转化大肠杆菌感受态细胞的分子克隆新方法及其应用。与传统方法相比，用于克隆的DNA片段和载体两端不受限制性内切酶位点限制，不受平滑末端或粘性末端影响，通过设计简单的接头引物，可将任何DNA片段与载体拼接起来，具有操作简单，实用性强、应用广泛的特点。

背景技术

基因克隆技术在生物学中发挥着重要作用，广泛应用于分子生物学、细胞生物学以及肿瘤生物学等领域，具有巨大的市场需求。传统的分子克隆实验包括：DNA片段制备、载体线性化处理、DNA片段与载体连接以及大肠杆菌感受态细胞转化等。为了将DNA片段与载体连接在一起，提高连接反应效率，通常需要预先分析载体和DNA片段序列，寻找单一特异的限制性内切酶酶切位点，将DNA片段和载体末端连接起来，以便后续连接、转化和筛选阳性克隆。然而，当DNA片断与载体序列上限制性酶切位点重合较多的情况下，选择特异性限制性酶切位点变得非常困难，严重的影响了连接转化效率。虽然利用DNA连接酶也可以将平滑末端DNA片段与线性载体连接起来，但是通常连接反应时间较长，并且连接反应效率很低。因此，发明一种通用的分子克隆方法，使得DNA片段和线性载体不受限制性内切酶酶切位点影响，不受平滑末端或粘性末端影响，并且可以在短时间内高效率完成克隆反应，无疑具有重要的应用价值。

为了提高基因克隆效率，满足不同长度基因克隆需求，各大生物公司不断推出种类繁多的载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、染色体载体等。载体上不仅含有多克隆位点,还含有氨苄霉素或卡那霉素抗性筛选基因，方便基因编辑操作。一些质粒载体(如pBR322、pUC18/19)含有可表达β-半乳糖苷酶活性的LacZ基因，PCR产物克隆后可利用α-互补性直接进行蓝白菌落筛选。目前应用较为广泛的载体是T-vector，由于线性载体3'末端带有“T”核苷酸，而PCR产物末端通常带有“A”核苷酸末端，因此DNA连接酶可以将PCR产物直接克隆到T载体上。然而利用“TA”克隆获得的产物，无法有效控制DNA片段连接方向，经常不能有效表达目的蛋白，而且容易出现假阳性，后续筛选工作量较大。因此很多载体带有多克隆位点，使用单一限制酶处理后，可以产生黏性末端，然后将带有相同酶切位点的PCR产物和线性载体连接，可以有效的提高转化效率。然而在连接酶的作用下，线性载体容易发生自身环化而造成假阳性，因此很多载体会使用两种不同的限制性内切酶进行线性化处理，从而产生不同的粘性末端，防止载体末端自连而降低克隆转化效率。这就要求目的基因两端带有与载体末端相同的酶切位点，对限制性内切酶位点的选择变得非常重要，需要了解目的基因和载体的全部序列信息，但是无法对未知基因进行克隆，通常需要在PCR引物上引入特异的酶切位点，以便后续进行克隆反应，因此操作步骤非常繁琐。

随着基因克隆技术的快速发展，各种快速反应的限制性内切酶、连接酶层出不穷。近些年，一些生物公司推出了“In fusion”技术，采用DNA重组酶代替原来的限制性内切酶和连接酶反应，通过在目的基因和载体两端设计同源引物序列，将目的基因与载体末端进行“置换”，从而达到基因克隆的目的。该方法虽然简化了实验操作，但是重组酶反应在引物设计方面较为复杂，同样存在难于控制基因片段插入的方向性问题，需要克隆载体上含有多种抗性筛选基因，以方便后续筛选阳性克隆。

发明内容