[发明专利]从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用

权利要求书

1.从胎盘羊膜制备人羊膜间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm 离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm 离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01~0.05%硝酸硫胺、0.05~0.1%麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5%CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，必要时对其进行传代培养。

2.根据权利要求1的方法，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

3.根据权利要求1的方法，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

4.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。