[发明专利]一种促进产油酵母生产油脂的方法

说明书

本发明公开了一种利用代谢工程策略构建高效生产微生物油脂菌株的方法和应用。本发明涉及在产油酵母中过表达磷酸乙酰基转移酶。该方法能够增强油脂合成前体乙酰辅酶A供应，提高油脂得率，能有效改善微生物油脂的经济性。

技术领域

本发明涉及磷酸乙酰基转移酶PTA，具体地说是依据枯草芽孢杆菌PTA蛋白序列，根据圆红冬孢酵母密码子偏好性优化后全基因合成的磷酸乙酰基转移酶PTA的重组载体构建，以及在代谢工程研究中的应用。

背景技术

油脂是一类氧含量低、能量密度高、富含碳氢元素的天然可再生资源，是液体生物燃料、油脂化工品、食品和材料等生产的基础原料，广泛应用于日常生产、生活各个方面[Jin MJ et al.Trends Biotechnol,2015,33:43-54.]。传统动、植物油脂产量有限，难以满足日益增长的需求，且存在着与人争粮，与农争地的问题，而微生物因其生长快、基本不依赖耕地、可连续生产、便于改造等特点，近年来显示出其突出的特点[赵宗保.中国生物工程杂志2005,25(2),8-11]。

自然界中部分微生物在极端情况(如氮源缺乏)能在胞内积累超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，这些微生物被称为产油微生物，主要包括细菌、酵母、霉菌、藻类等[Ratledge C,Wynn J P.Adv Appl Microbiol 2002,51,1-51]。油脂的合成需要大量的乙酰辅酶A和NADPH作为前体和还原力。通常乙酰辅酶A是微生物可降解的糖类物质经过细胞内的中心代谢途径和三羧酸生成，在这一过程中有1/3的碳原子以CO₂的形式释放，使得糖类物质到油脂的理论得率(w/w)仅为0.30-0.33，碳原子经济性较差[Bogorad IWet al.PNAS 2014,111,15928-15933]。

磷酸乙酰基转移酶(phosphate acetyltransferase，PTA)可以催化乙酰磷酸到乙酰辅酶A的转化，为生物体内蛋白质、糖类、油脂的合成提供前体[Bock AK etal.J.Bacteriol 1999,1861-1867]。乙酰磷酸的来源中共有三种途径：1.乙酸经乙酸激酶活化；2.木酮糖磷酸经木酮糖磷酸激酶作用生成；3.己酮糖磷酸经己酮糖磷酸激酶催化生成，这些酶已经被证实存在于圆红冬孢酵母酵母基因组内[Zhu ZW et al.Nat common2012,3,1112]。因而引入PTA有可能增加乙酰辅酶A合成效率。另外，利用PTA催化乙酰磷酸到乙酰辅酶A，可绕过细胞内中心代谢途径，减少CO₂生成。因此，过表达PTA可将糖类物质到油脂的提高理论得率[Bogorad IW et al.Nature 2013,502,693-697]。

但是，至今为止未有人在产油酵母的中进行过PTA基因的过表达，也没有人使用这个基因进行过油脂的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强乙酰辅酶A供应能力，提高底物到油脂质量得率的方法。具体来说，是在产油酵母中过表达磷酸乙酰基转移酶PTA，增加胞内乙酰辅酶A供应，提高微生物油脂的生效率及底物到油脂的得率。

本发明中磷酸乙酰基转移酶PTA的蛋白质序列源自枯草芽孢杆菌，委托苏州弘迅生物科技有限公司对磷酸乙酰基转移酶PTA基因按照R.toruloides密码子偏好性进行核酸序列设计并全基因合成，优化后的基因序列与源基因序列不同，GC含量由42％提高至62％的差异，具体序列见SEQ ID No.1。

本发明的菌株构建方法涉及的启动子Pgpd，终止子Thsp，均克隆自R.toruloides，序列见附录。

为实验上述目的，本发明采用的技术方案为：

首先，根据产油酵母密码子偏好性全基因从头合成PTA核酸序列。而后通过将其导入产油酵母中进行过表达，获得了大量油脂含量及得率提高的菌株。