[发明专利]一种三七发状根系制备方法

说明书

本发明涉及一种三七发状根系制备方法，属于医药制备技术领域。本发明三七发状根系制备方法为：(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl₂+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3‑5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3‑5次，放置在不含任何激素的MS固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。(2)在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染30 min，90r/min、28℃。

技术领域

本发明涉及一种三七发状根系制备方法，属于生物医药制备技术领域。。

背景技术

三七（Panax notoginseng F. H. Chen）为五加科人参属植物。明代著名药学家李时珍称其 为“全不须”。清朝药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一， 三七补血第一”，味同而功亦等，故称人参、三七为中药中之最珍贵者。《中药大辞典》（1997年版）“ 三七功用补血，去瘀损，止血，能通能补，功效最良，是方药中之最珍贵者。三七生吃，去瘀生新，消肿定痛，并有止血不留瘀血，行血不伤新的优点；熟服可补益健体。”三七是多种药物的主要成分，如云南白药、三七通舒胶囊、三七止血胶囊等，因此三七被人们誉为“人参之王”。三七市场需求量与日俱增。

在生物工程与基因技术发展的同时，利用发根农杆菌诱导药用植物产生的发状根能合成该植物体中有效药用成分。对其发状根进行离体扩增培养，因其生长迅速、稳定性强、变异性弱等特点成为实现濒危药用植物资源可持续发展的有效途径之一。并且发状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制，所以，利用发状根培养技术标准化生产三七发状根从而替代野生植物资源，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且解决了栽培困难，病虫害多，产量低且不稳定等难题。也为三七等民族药的现代化工业生产提供了新的思路。因此，建立三七发状根培养体系大量生产三七药用原材料具有重要意义。

研究表明，发根农杆菌Ri质粒转化药用植物可诱导其发状根产生，已成功的利用Ri质粒对包括27科55属的许多草本植物和一些林木与果树进行转化，如金铁锁、毛白杨等是迄今发状根诱导比较成功的例子。发状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点：（1）发状根生长速度快、次生代谢产物含量高；(2)发状根中染色体和次生代谢产物合成相对稳定； (3)所得的产物可从培养体系内直接提取、回收和利用，简化生产步骤；(4)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的制约；(5)有利于生物转化，细胞筛选，控制新成分的合成，得到价值更高的产品；(6)节省大量种植原料的农田。正是因为发状根具有诸多优点，从而为其工业化生产优质中草药原材料提供了保证，成为继组织培养和细胞培养之后现代生物技术领域中重要的研究与开发热点。

利用植物发状根进行天然物质的生产已经被人类广泛关注，通过发状根培养已经分离出生物碱类、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶等。据不完全统计，目前国内外已对23科50余种药用植物进行发状根制备的研究，建立培养体系，获得次生代谢产物。

发明内容

本发明的目的是公开一种三七发状根系制备方法。

本发明采取的技术方案：

取三七叶片为外植体进行消毒、脱分化处理，获得较好的三七愈伤组织，使用含有Ri质粒的发根农杆菌(ATCC11325，保藏单位缩写和菌种编号)侵染愈伤组织后，转入到共培养培养基中进行共培养，然后进行除菌培养，在三七愈伤组织处生长出三七的发状根，将具有发状根的愈伤组织转入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。