[发明专利]一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法。本发明采取的技术方案如下：选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4‑D + 0.5 mg/L 6‑BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3‑4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地说它是一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法，并生产有效的次生代谢产物的方法。

背景技术

三七（(Panaxnotoginseng(Burk)F．H．Chen）为五加科人参属，多年生草本双子叶植物，又有金不换、田七、参三七等之称，是我国特有的名贵药用植物。三七味苦微甘、性平，主要是以块根和根茎入药，主要的药用成分有三七总皂苷（PNS）、三七素、黄铜、挥发油、氨基酸、糖类及各种微量元素等。经药理研究发现，三七的功效有活血化瘀、消肿定痛、抗肿瘤、滋补强壮、降血糖、抗血栓等，主用于跌打损伤、咳血、吐血、便血等。三七是众多中成药的主要成分之一，例如云南白药、心痛宁片、复方三七胶囊等。因此，三七具有非常大的经济价值和社会效益。

近年来三七的药用价值不断为人们所知，因此其药用需求量不断增加，其野生资源连年开采过度、私采严重。由于森林砍伐、植被石漠化、土层流失等原因，三七的生态环境也受到严重破坏。再加上自然气候影响及三七本身自然繁殖力差等诸多因素，造成三七野生资源数量急剧下降。

由于三七药材主要靠采收野生资源，收获周期较长，受病虫害、气候等外部因素影响大，造成供应量不易控制等实际问题。虽然三七的GAP栽培种植面积也在不断扩大，但是在栽培过程中的土壤环境恶化及连作障碍危害也日益突出。目前, 三七连作区面积高达总种植面积的15% , 每年由此造成的损失在上千万元。连作障碍已成为影响道地产区文山州三七产业可持续发展的重要制约因素。因此，寻求新的替代品或新技术以满足市场需求和解决物种保护问题迫在眉睫。

综合考虑，采用生物技术方法是解决这一问题最为有效的途径。一方面可以缓解植物资源的匮乏，保护珍贵的野生植物资源，避免掠夺性开发；另一方面通过规模化的细胞培养技术可以定向调节细胞的次生代谢产物，使植物细胞定向合成有效的物质，以提高、调控中药材有效成分含量，提高它的药用价值和疗效，降低中药材生产的经济成本。尽管如此，通过细胞培养等手段实现商业化生产的植物种类有限，主要原因是遗传和药用成分生物合成的稳定性差以及单位时间内生物量小等，因此，筛选优质高产细胞株是解决上述瓶颈问题的关键技术环节。

毛状根是利用发根农杆菌侵染植物细胞后产生的特殊的不定根，具有遗传稳定、激素自养、生长速度快以及次级代谢强等优点。毛状根作为一种转基因器官，一种新的药用原料，日益受到国内外研究者的关注。试验表明，利用毛状根作为外植体而诱导的愈伤组织，也具有毛状根的生长速度快、遗传稳定等优点，与普通三七愈伤组织相比，固体培养条件下较短时间内能够获得较高的细胞产量，同时皂苷含量也较高。毛状根在悬浮培养体系下具有成团性的特点，随着培养时间的延长，内部的毛状根组织由于没有足够的氧供给和养分循环供应而逐渐衰老甚至褐化死亡，导致生长速度下降从而影响收获产量。因此，利用毛状根的愈伤组织建立悬浮细胞培养体系并优化培养条件，可以解决困扰毛状根放大培养过程中的成团性问题。

发明内容

本发明的目的是公开一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法。

本发明采取的技术方案如下：

1. 选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3-4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d。