[发明专利]一种用于大肠杆菌电泳样品制备的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种用于大肠杆菌电泳样品制备的新的方法，涉及生物样品制备技术领域。

背景技术

在大肠杆菌的生物反应器罐发酵培养中，有一种方式是高密度发酵，通过不断的添加补料和补充溶氧，大肠杆菌的生长可以长期保持在对数生长期，增殖的大肠杆菌的数量可以实现指数级的增长，大肠杆菌的浓度很高，发酵液的OD值可以在30--150。在发酵工艺的研究中，需要在不同的时间段抽取发酵液的样品进行电泳检测，分析大肠杆菌的生长状况和我们需要的目的蛋白的表达情况，以优化和建立大肠杆菌的发酵工艺。

大肠杆菌蛋白电泳的常规方法是：将发酵液离心后，用50µL水重悬沉淀，加入50µL的凝胶加样缓冲液（含有50mmol/L Tris.Cl，10mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油），100℃沸水中煮沸3-5min，离心后取上清液加入样品孔，进行电泳。

对于高密度发酵的大肠杆菌发酵液样品，采用常规的处理方法和凝胶加样缓冲液，常常由于菌浓度太高，特别是发酵液的OD值超过40时，在沸水浴煮沸裂解菌体时，大量的菌体不能实现很好的裂解，释放的菌体内的蛋白、核酸和其他成分导致样品溶液的粘度很大，菌液粘在一起，离心后的上清液很少，难以用移液器准确的定量吸取。不仅在向样品孔中加样时增添了很大困难，而且不能保证加样量的准确度。电泳的结果很差，在凝胶上出现条带不清晰、背景不干净、产生弥散带的现象。

对于应用生物反应器高密度发酵培养的大肠杆菌样品，本发明设计的蛋白电泳的样品制备方法，增加了样品处理的步骤，在凝胶加样缓冲液中增加了新的成分，包括：10-20% Triton X-100，10-20%异丙醇，10-15%山梨醇，有助于溶解大肠杆菌裂解后释放出的脂类物质等粘性物质，以解决制备的样品粘度大，难以移取的问题。在样品煮沸裂解、离心后，收获的上清液的澄清度很高，保证了加样量的准确度，取得了良好的电泳结果。

发明内容

本发明提供一种用于大肠杆菌电泳样品制备的新的方法，达到取得理想的电泳分析、检测结果的目的，

本发明提供的一种制备大肠杆菌发酵液的电泳样品的方法，包括以下步骤：

1）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1分钟，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（重悬沉淀，1000rpm离心1 min，弃去上清液收获沉淀；加入1mL洗涤液重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1 min，弃去上清液收获沉淀；向沉淀中加入200µL H₂O重悬沉淀，加入凝胶加样缓冲液200µL，100℃沸水中煮沸5-10min，1000rpm离心1 min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；

2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120min，结束电泳，即得目标产物。

本发明所述的PBS缓冲液由20mM 磷酸氢二钠、20mM磷酸二氢钠、145mM NaCl制成，pH7.4。

本发明所述洗涤液由0.5M尿素、10% Triton X-100、50mmol/LTris.Cl制成，pH6.8。

本发明所述的凝胶加样缓冲液由10-20% Triton X-100、10-20%异丙醇、10-15%山梨醇、50mmol/L Tris.Cl、10mmol/L DTT、2% SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油混合而成。

本发明的积极效果在于：

对于高密度发酵培养的大肠杆菌发酵液，可以在处理样品时很好的实现大肠杆菌的裂解，有效降低粘度，确保样品移取的准确度，取得好的电泳检测结果。本发明制备的电泳通过考马斯亮蓝法染色和脱色，脱色结束后，将凝胶置于纯化水中，电泳条带清晰，色差明显，背景干净，无弥散带和杂带干扰。

附图说明

图1. 实施例1的大肠杆菌发酵液的电泳结果图；

图2. 实施例2的大肠杆菌发酵液的电泳结果图；

图3. 实施例3的大肠杆菌发酵液的电泳结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1