[发明专利]一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。该方法包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌。该方法通过第一步宏基因组特异性片段的扩增，就能将绝大多数不含产BSH的植物乳杆菌样品滤除，避免了盲目筛选，大大缩小了筛选范围，具有定向、快速、简便、工作量小等特点。

技术领域

本发明涉及一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

近几十年来，心血管疾病成为了全人类死亡的首要原因。临床试验表明，血清胆固醇水平过高是引起心血管疾病的主要致病性因素。当机体超过血清胆固醇水平的正常值(0～5.2mmo/L)时就表现为高胆固醇，而导致机体罹患肾病、心脏疾病、脑中风等。机体内胆固醇水平每增加1％，将会使心血管疾病的患病风险增加35％。调查发现，2012年全球范围内由心血管疾病导致的死亡人数(大约1750万)占全人类死亡总数的31％左右，其中近42％的人死于冠心病，而近38％的人死于脑中风。血清低密度脂蛋白(low densith lipoproteincholesterol，LDL-C)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)和甘油三脂(triglyceride，TG)含量的升高，以及高密度脂蛋白(High densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)水平的降低与动脉硬化之间存在紧密的关系。流行病学调查表明，HDL-C水平每增加0.01μg/L，患心血管疾病的风险将降低3％。Bruckert等调查研究了在8545名欧洲血脂异常患者由较低HDL-C水平引起的患病率，当男性血清HDL-C低于1.03mmol/L时，其患病率为33％，当女性HDL-C低于1.29mmol/L时，其患病率为40％。探求一种相对安全、毒害小且便于人们使用的预防高胆固醇血症的方法势在必行。

对于高血脂症，目前较成熟的防治对策主要包括以下几种：1)饮食疗法：摄入胆固醇含量少的食物，不吃动物内脏、蛋黄、荤油等富含胆固醇的食物；2)适量运动：运动能增加机体脂质消耗，同时加快血清中LDL-C和TG的分解和排泄；3)药物治疗：服用洛伐他汀、莫那可林、普伐他汀等药物，但由于目前尚缺乏理想的降血脂药物，且大部分药物花费较高、疗效短暂、有副作用，所以药物疗法并非首选方法；4)物理和化学方法：如溶剂提取、蒸馏、萃取等；5)生物方法：利用微生物直接或间接降解食物或体内的胆固醇水平，如乳酸菌能降低机体胆固醇水平。

国外关于乳酸菌降胆固醇作用的研究起步较早。最初，Mann等对长期饮用乳酸菌发酵制品的非洲Maasai部落进行研究发现其体内胆固醇水平较低，且进一步研究发现长期饮用酸奶和其他乳制品的美国人体内胆固醇水平也较低。这些结果引起国内外研究者的广泛关注，引发了对乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。Gilliland等分离筛选出一株嗜酸乳杆菌，该菌株能降低培养基中胆固醇的浓度。Salaj等发现植物乳杆菌LS/07能降低大鼠血清TC和LDL-C水平，而植物乳杆菌Biocenol LP96能降低TG和VLDL水平，但同时不改变血清高密度脂蛋白和肝脏脂质水平。Tomaro-Duchesneau等对11株乳酸菌的胆固醇同化作用进行了研究，在MRS肉汤培养基中L.plantarum ATCC 14917同化胆固醇能力最高，达到15.18±0.55mg/10¹⁰cfu，而体外模拟肠道环境条件下L.reuteri NCIMB 701089同化胆固醇能力最高，达到2254.70±63.33mg/10¹⁰cfu。Singh等从哺乳期的婴儿粪便中分离出L.reuteriLR6，经体内外试验发现该菌株不仅具有降胆固醇能力，还表现出BSH活性。