[发明专利]一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用，该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9532。本发明所用的发酵培养基：55～70 g/L甘露醇，3～6 g/L大豆蛋白胨，3～6 g/L牛肉膏，0.8～1.2 g/L NH₄NO₃，1.5～2.5 g/L(NH₄)₂SO₄，1.5～2.5 g/L MnSO₄，3～5 g/L MgSO₄，0.4～0.8 g/L NaH₂PO₄，2～4 g/L K₂HPO₄，2.5～5 g/L粉末壳聚糖。本发明的培养方法简单，生产壳聚糖酶活力高，酶转化制备的壳寡糖纯度高，具有较大的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产壳聚糖酶的方法，及其在壳寡糖制备中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在 2-20且可溶于水的氨基糖类化合物，具有独特的生理活性和优越的功能性质，在食品、工业、医药和化工领域具有重要应用。

壳聚糖酶(Chitosanase，EC 3.2.1.132) 是一类催化氨基葡萄糖间的 β-1,4-糖苷键断裂，专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，是在催化壳聚糖底物水解转化制备壳寡糖的产业化领域具有重要应用前景的酶类，尤其是在低分子量且高生理活性的壳寡糖制备方面的应用引人注目。根据其作用位点不同，壳聚糖酶可分为3类：1）水解 GlcN-GlcN 键及GlcNAc-G1cN 键；2）只能水解 G1cN-GlcN 键；3）既可水解G1cN-GlcN 键又可水解 G1cN-GlcNAc 键。所有壳聚糖酶有一个共同催化性质就是要求糖苷键的一侧至少有1个G1cN 残基，而不能催化 GlcNAc-G1cNAc键的断裂，不同生物来源壳聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成产物壳寡糖聚合度存在差异。

壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌、蓝藻和植物等生物体中，而微生物是其最适的规模生产来源，选取产酶量高、易于培养且非致病来源生物体就显得尤为重要。本发明是在筛选获得一株促进海马健康养殖的芽孢杆菌（发明专利CN 104232541 A）的基础上，发现该菌株也高产壳聚糖酶，且其为益生菌，以此确定其培养方法，进一步应用于生物转化制造壳寡糖领域。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种芽孢杆菌HS17发酵生产高活性壳聚糖酶的培养方法及其应用，以解淀粉芽孢杆菌HS17为出发菌株，经液体发酵的方法生产壳聚糖酶，该酶可通过高效水解壳聚糖来生产高生理活性的壳寡糖。

所用的芽孢杆菌HS17具有高产壳聚糖酶的特性，其保藏名称为：HS17，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月20日，保藏号为CGMCC No.9532，分类命名：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

（1）菌种活化：取试管斜面保存的菌种转接活化培养基中，于30℃、200rpm下活化24 h至菌体混浊，制得活化种子液；

进一步，所述的活化培养基（g/L）：酵母粉3～6，蛋白胨8～12，磷酸二氢钾1～3，硫酸镁0.5～1.5，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20min备用。

（2）发酵生产壳聚糖酶：