[发明专利]一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法

权利要求书

1.芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌在麦芽糖转化生成海藻糖体系中的应用，步骤如下：

（1）将芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中于37℃下活化培养3～4 h，然后按体积百分比为1%的比例接种于装液量为30～50mL三角瓶，其中抗生素浓度为25mg/mL，培养条件为35～37℃、200～220rpm、10～14h，得到Bacillus Subtilis 168ΔsleBΔcwlJ的菌液；

活化培养基配方如下，单位g/L：

蛋白胨9～11、酵母浸粉5～7、氯化钠9～11，蒸馏水定容，pH7.0～7.4；121℃灭菌20～30min；

（2）将步骤（1）中得到Bacillus Subtilis 168ΔsleBΔcwlJ的菌液按体积百分比2～4%的接种量接种于80～100mL发酵培养基中，在35～37℃、180～220 rpm的条件下摇瓶发酵48h，得到发酵液；

摇瓶发酵培养基组分如下，单位g/L：

葡萄糖5～10、玉米浆10～15、磷酸二氢钾2～3、硫酸锰0.3～0.5、结晶硫酸镁2～3、氯化钠4～6，蒸馏水定容；115℃灭菌20～30min；

所述芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：

（i）以枯草芽孢杆菌168 DNA为模板，进行PCR扩增，分别得到sleB1，cwlJ1片段；

sleB1片段扩增的PCR引物序列如下：

sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’；

sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’；

cwlJ1片段扩增的PCR引物序列如下：

cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’；

cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’；

（ii）以质粒pPIC9k为模板，进行PCR扩增，得到km^r片段；

所述的km^r片段PCR扩增引物序列如下：

km^r-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’；

km^r-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；

(iii)以pPICZαA质粒为模板，进行PCR扩增，得到zeo^r片段；

所述的zeo^r片段PCR扩增引物序列如下：

zeo^r-up: 5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’；

zeo^r-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’；

（iv）利用重叠PCR技术连接sleB1和km^r片段，制得sleB1-km^r片段，步骤如下：

初次PCR扩增，扩增体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板sleB1 1μl，模板km^r 1μl，用ddH₂O补足25μl；

初次PCR扩增，扩增程序如下：

95℃预变性5 min；94℃变性30 sec，57℃退火30 sec，72℃延伸3.5 min，5个循环；

补充PCR扩增，扩增体系如下：

向初次扩增后的体系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，10μmol/L 引物sleB-up1 μl，10μmol/L 引物km^r-down 1 μl，用ddH₂O补足50μl；

补充PCR扩增，扩增程序如下：

95℃预变性5 min；94℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃延伸 4.5 min，30个循环；72℃延伸10 min，-20℃保存；

（v）利用重叠PCR技术连接cwlJ1和zeo^r片段，制得cwlJ1-zeo^r片段，步骤如下：

初次PCR扩增，扩增体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板cwlJ1 1μl，模板zeo^r 1μl，用ddH₂O补足25μl；

初次PCR扩增，扩增程序如下：

95℃预变性5 min；94℃变性30 sec，57℃退火30 sec，72℃延伸3min，5个循环；

补充PCR扩增，扩增体系如下：

向初次扩增后的体系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，10μmol/L 引物cwlJ-up1 μl，10μmol/L 引物zeo^r-down 1 μl，用ddH₂O补足50μl；

补充PCR扩增，扩增程序如下：

95℃预变性5 min；94℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃延伸 4 min，30个循环；72℃延伸10 min，-20℃保存；

（vi）将步骤（iv）制得的sleB1-km^r片段转化枯草芽孢杆菌168获得sleB基因缺失菌后，再将步骤（v）制得的cwlJ1-zeo^r基因转化sleB基因缺失菌中获得sleB，cwlJ基因双缺失菌株，经筛选，制得芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。