[发明专利]一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物医药领域，具体涉及一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液和制备方法及其使用方法。

背景技术

小儿脑瘫通常指出生前到出生后一个月内由各种原因引起的非进行性脑损伤或脑发育异常所导致的中枢性运动障碍。临床上以姿势与肌张力异常、肌无力、不自主运动和共济失调等为特征，常伴有感觉、认知、交流、行为等障碍和继发性骨骼肌肉异常，并可有癫痫发作，该病目前无理想的治疗手段，致残率高，给患者本人及家庭造成的精神负担和经济负担重。

根据卫生部发布的数据计算，我国每年新生儿1600万人，据不同统计，小儿脑瘫发病率在千分之二到千分之五左右，即每年3-8万人；而由于以往人口出生率高、医疗条件落后导致发病率高、治愈率低等原因，有报道称我国已有累积小儿脑瘫患者500万人。因此该病危害十分严重。

小儿脑瘫目前常用的治疗方式有物理治疗、作业治疗、家庭训练、矫形器等。常用的药物有脑神经营养药、肌肉松弛剂等，然而药物治疗只有在必要时才使用，它不能替代功能性训练。注射用鼠神经生长因子是被SFDA批准的一种生物制剂，提取自小鼠的颌下腺，与人的同源性达90％，采用肌肉注射的方式给药，据报道对小儿脑瘫引起的肌张力、运动发育、姿势异常、反射异常等症状有一定改善效果。

目前所有的治疗小儿脑瘫的药物大多为提供营养，缓解症状，不能达到治疗的目的。也就是说，目前市场上并没有特异性治疗小儿脑瘫的有效药物。在临床上通常采取药物和运动康复相结合的办法。最近CFDA批准的一种注射用鼠神经生长因子生物制剂用于小儿脑瘫的治疗，该药物来源于小鼠的额下腺，与人的同源性达90％，采用肌肉注射方式给药，据报道对小儿脑瘫引起的肌张力，运动发育，姿势异常，反射异常等症状有一定改善效果。

脑损伤主要还包括脑中风和创伤性脑损伤，国内外已有大量临床前实验研究表明神经干细胞(NSC)对于脑中风和创伤性脑损伤有一定的治疗效果。并且有部分临床试验证明NSC移植能够治疗脑损伤。神经干细胞(NSC)是一群较原始的、能自我更新并具有多种分化潜能的细胞,可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。在生理条件下,体内的NSC通常保持静息状态；神经损伤后,内源性NSC可因微环境的改变而被激活、迁移和分化,以替代损伤的细胞和重建神经环路；遗传修饰后,外源性NSC移植显示了很大的治疗潜力,为脑损伤的治疗提供了新的手段。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液和制备方法及其使用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1：原代细胞培养：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；

其中，原代神经干细胞的来源为哺乳动物、灵长类动物或啮齿类动物的神经干细胞中的一种或几种；所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，然后消化酶将组织消化离心获得原代神经干细胞悬液；原代神经干细胞的来源方法包括IPSC诱导、提取胚胎干细胞、提取人类视网膜色素上皮细胞或提取神经组织器官以外的其他器官或组织干细胞。

优选的，原代神经干细胞的来源为医疗废弃的人源胎脑皮层组织的神经干细胞。这种来源为完全100％人源，是一种单一的干细胞产品，用自主研发的无血清培养基和培养工艺，在体外培养到P3代，干细胞纯度可达95％以上，神经干细胞活性在90％以上。

优选的，所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x10⁵个/ml，然后接种至超低吸附培养瓶中，放入35℃5％CO₂中环境中进行培养。

其中，无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。

S2：神经干细胞纯化及扩大培养：将扩增满的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代,并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；P5到P8代都可作为种子细胞，种子细胞可以冻存，便于保存。

所述扩增满为至细胞直径超过300μm，然后进行消化传代至P1代神经干细胞；培养方法为连续培养10-14天，期间每24小时进行观察，确认细胞生长状态正常，每隔48-72小时进行换液；悬浮培养和贴壁培养的神经干细胞在显微镜下的形态见图1。