[发明专利]一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法

权利要求书

1.一种适用于牛BVDV、IBRV、PI3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法，其特征是，包括以下步骤：

1）选择适宜牛病毒性腹泻病毒及牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒或牛呼吸道合胞体病毒在适宜生长的细胞系进行复苏培养；

2）选用2个已长成良好细胞单层，密度达80%-90% 的适宜体积的转瓶，弃去细胞培养液，取灭活后的病毒液20-30ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO₂培养箱中，使灭活后的病毒液在前述适宜细胞上吸附40-60min，期间振摇2-3次；

3）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液，将细胞转瓶置于37℃的CO₂培养箱中继续培养3-4日后，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2-3次；

4）取冻融后的细胞培养液10-15ml，接种于175cm²方瓶已生长至密度为80%-90% 的适宜细胞上吸附40-60min后，在细胞转瓶中加入营养维持液，将细胞瓶置于37℃的CO₂培养箱中继续培养3天，对于可出现细胞病变的病毒液，观察细胞病变，如无细胞病变，则表明灭活完全；

5）对于正常不出现细胞病变的病毒液，收获培养液，进一步进行荧光染色，如没有特异性荧光，则表明灭活完全；如出现特异性荧光，则灭活不完全。

2.根据权利要求1所述的适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法，其特征是，步骤5中荧光染色的方式为：取正常不出现细胞病变的病毒培养液接种于长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板内，每孔0.1mL，设阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔各4孔，置于37℃的CO₂培养箱中继续培养24小时，弃去培养液，用PBS清洗，用80%丙酮和20%甲醇混合液0.1mL在-20℃下固定30min，用PBS清洗，分别加入浓度为2.5μg/ml的牛对应病毒单克隆荧光抗体0.1mL，37℃湿盒中作用40min后，用PBS清洗，置于荧光显微镜下观察结果,阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔应无荧光,试验孔如没有特异性荧光，则表明灭活完全；如出现特异性荧光，则灭活不完全。