[发明专利]全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法

说明书

本发明公开了一种全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法：在外周血单个核细胞悬液中加入浓度为5g/ml的全长骨桥蛋白稀释液，放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱培养48±2小时，从而实现对外周血单个核细胞中的树突状细胞的活化；所述外周血单个核细胞悬液与全长骨桥蛋白稀释液的用量比为：1ml/(50±5)ul。

技术领域

本发明涉及细胞生物工程领域，具体为一种骨桥蛋白活化树突状细胞的方法。

背景技术

全长骨桥蛋白(osteopontin,OPN)作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织和细胞中，其相对分子质量约为44kDa，约含300个氨基酸残基，骨桥蛋白多肽链的二级结构中包括8个α螺旋和6个β折叠结构，高度保守的RGD基元两端各有一个β折叠结构，分子中心部位是a螺旋结构。全长骨桥蛋白中包括凝血酶裂解位点：RGD序列结构中有RS位点，位于RGD序列羧基端第6位氨基酸残基所形成的肽键，是凝血酶的裂解位点，可将其裂解成45kD及24kD两个片断。其中45kD片断更能刺激细胞的黏附和迁移。

OPN广泛的分布于多种组织和细胞中，能够参与组织修复，自身代谢等功能。正常情况下其表达甚微的细胞，如巨噬细胞、SMC、T淋巴细胞、成纤维细胞等在一些诱导因素下可以大量表达OPN，包括：(1)高血压，(2)高血糖，(3)低氧，(4)干扰素，(5)成纤维细胞生长因子，(6)其他因素。

OPN可表达于各种组织里，不同细胞类型也能表达OPN，如骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞(SMC)、活化的T细胞、MФ和自然杀伤细胞(NK)细胞亚群；OPN也存在正常体液里，如血清、乳汁、尿液，胆汁。病理状态(免疫性疾病、炎症和肿瘤)OPN表达增强，如大肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌及各种转化细胞系亦能高水平表达OPN。

外周血单个核细胞，PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。树突状细胞(Dendritic cells,DC)，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟树突状细胞具有较强的迁移能力，成熟树突状细胞能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

树突状细胞自身具有免疫刺激能力，是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞的APC。人体内大部分树突状细胞处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟树突状细胞具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟树突状细胞，而成熟的树突状细胞表达高水平的共刺激因子和粘附因子。树突状细胞在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与T细胞接触并激发免疫应答。

T细胞的有效活化需要两个信号的参与，即需要抗原肽-MHC复合物与TCR-CD 3结合提供第1信号，以及共刺激分子介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的CD80、CD86分子与T细胞上表达的相应受体提供。

树突状细胞作为目前发现的功能最强的APC，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年来研究表明,应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏树突状细胞，回输或免疫接种于载瘤宿主，可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。