[发明专利]一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法

权利要求书

1.一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，其特征在于，具体制备过程包括如下步骤：

（1）设计引物，并对VEGFR-2胞外区基因片段进行PCR扩增，所述VEGFR-2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段具体为：VEGFR2-1-7；

所述VEGFR2-1-7的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

PCR扩增时，引物序列设计如下：

Sal1-Ig1-F：5’-acgcgtcgacatggcctctgtgggtttgcct-3’，

Nde1-Ig7-R：5’- cggaattccatatgttccaagttggtcttttcctgg-3’；

（2）酶切、连接，构建含有VEGFR-2 基因片段的重组质粒；

对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物备用；

对质粒同样采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物；

用T4-DNA连接酶将上述所回收的PCR酶切产物与质粒的酶切产物进行连接；

（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：

将步骤（2）中的连接产物转化，并进行抗性筛选；

对鉴定正确的阳性克隆菌株进行扩增，并提取质粒备用；

（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒转化大肠杆菌BL21，并筛选、扩增，备用；

（5）噬菌体重组及培养，具体为：

取步骤（4）中含有重组质粒的大肠杆菌BL21培养液，接种溶菌酶缺陷型T4噬菌体，继续培养，即可获得重组的T4噬菌体。

2.如权利要求1所述展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，接种噬菌体时，首次接种后，间隔15min，重复接种一次。

3.如权利要求1所述展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，对重组的T4噬菌体用含有大肠杆菌BL21菌液的双层S.C培养基平板进行筛选鉴定；

所述双层S.C培养基平板，通过如下方法制备而成：

配制顶层S.C培养基：称量1g Tryptone、0.5g NaCl和0.7g Noble Agar，加入到100mL去离子水中，高压灭菌后冷却至55℃，再加入已灭菌的5mL、1M的 pH=8.0的Tris-HCl、1mL的25% 柠檬酸钠·2H₂O，充分混匀，冷却并4℃保存备用，使用时微波炉加热熔化；

配制底层S.C培养基：称量10g Tryptone、5g NaCl和12g Noble Agar，加入到1L去离子水中，高压灭菌后冷却至55℃，加入已灭菌的50mL、1M 的pH=8.0的Tris-HCl、10mL的25% 柠檬酸钠·2H₂O，充分混匀，倒于直径为90mm的平皿上，即为底层S.C培养基平板；

具体筛选鉴定时，取0.3mL 采用LB培养基过夜培养的大肠杆菌BL21菌液，加入3mL熔化并冷却至45℃的顶层S.C培养基，立即倒于底层S.C培养基平板上，常温放置待顶层培养基凝固后即为双层S.C培养基平板。

4.利用权利要求1~3任一项所述展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法所制备的重组T4噬菌体。

5.权利要求4所述重组T4噬菌体在制备肿瘤疾病药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌或结肠癌所致肿瘤。