[发明专利]一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法

权利要求书

1.一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14中含有3个基因cas7-5-3，经蛋白表达质粒构建、基因编辑质粒构建和重组子的获取与检验步骤可对原核生物基因组进行编辑。

2.根据权利要求1所述的一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：步骤如下：

（1）根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3及相关信息序列设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，用DNA聚合酶通过PCR反应扩增得到cas7-5-3基因，并连接到质粒plasmid上，得Cas7-5-3蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3；

（2）根据原核生物靶向基因DNA序列信息设计引物，以原核生物基因组为模版，通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlap PCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段，并用overlap PCR将上下同源臂连接得基因编辑模版template DNA/t-DNA，同时根据原核生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别包含乳糖操纵子启动子和RNA终止子的靶向基因片段guide-DNA/g-DNA，并根据限制性酶切位点上的粘性末端将基因编辑模版与靶向基因片段连接到质粒上得到基因编辑质粒plasmid-t/gDNA；

（3）制备原核生物细胞感受态，并将按步骤（1）得到的蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3和按步骤（2）得到的各种靶向基因编辑质粒分别转化到目标菌感受态中得到不同的基因编辑后的重组子；对重组子染色体进行PCR和基因测序和/或功能分析，以确证编辑后的目的重组子。

3.根据权利要求1所述的一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：所述原核生物指大肠杆菌、枯草杆菌及其它原核微生物。

4.根据权利要求1所述的一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑指应用该蛋白表达质粒结合基因编辑质粒或其它质粒可对原核细胞的染色体基因进行敲除、插入、无痕点突变及任意组合。