[发明专利]一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法。

背景技术

脂肪组织(adipose tissue)：主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。脂肪组织中的网状纤维很发达。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)，即通常所说的脂肪组织。它由大量单泡脂肪细胞集聚而成，脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下组织、网膜和肠系膜等处，在成年男子一般约占体重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪组织是人体内最大的“能源库”。具有贮存脂肪、保持体温和参与脂肪代谢的功能。参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。

自体脂肪是一种理想的填充材料，几乎可用于全身各个部位的软组织缺损填充。尽管为了提高成活率和减少吸收率，国内外的研究人员进行了大量的研究，但目前移植后脂肪组织体积最终只能保持在移植时的50％左右。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植提高脂肪移植成活率，以达到患者满意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了医生的工作量外，对患者造成多次抽脂的痛苦、较高的风险及费用。如果能实现一次抽取足够的脂肪体外长期冷冻储存，需要时复温培养后注射移植，则具有重要的临床应用价值。

目前尚未有专们用于脂肪组织冻存的方法，经典的冻存液配方是FBS+DMSO，主要用在细胞冻存上，但该冻存液对脂肪组织的保存效果并不稳定。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法，以本发明提供的冻存液冻存脂肪组织，能够保护脂肪组织的活性，经复融后脂肪组织中的细胞仍保持良好的分化能力。

本发明提供的冻存液包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。

非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。NEAA可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的NEAA为购自sigma的100×NEAA。本发明中，NEAA的体积分数为1％。

DMSO：二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，分子式为(CH₃)₂SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡，本发明实施例中，DMSO的体积分数为10％～20％；一个具体实施例中，DMSO的体积分数为20％。

丙三醇为无色味甜澄明黏稠液体。无臭，有暖甜味，俗称甘油。具有保护细胞活性的作用。本发明实施例中，丙三醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，丙三醇的体积分数为15％。

1,2-丙二醇的化学式为C₃H₈O₂；其可与水、乙醇及多种有机溶剂混溶，具有保护细胞活性的作用。本发明实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为15％。

本发明实施例中，基础培养液DMEM/F12。

本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明实施例中，基础培养基为DMEM/F12。

一些具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：

一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：

一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：

一个具体实施例中，本发明提供的冻存液包括：

本发明提供的冻存液在脂肪组织冻存中的应用。

本发明实施例中，以本发明提供的冻存液冻存脂肪组织，3个月后复苏并进行原代分离培养，结果表明，复苏后的脂肪组织原代分离获得脂肪干细胞的成功率为100％。培养至第三代后，诱导脂肪干细胞向脂肪细胞分化。

本发明还提供了一种冻存脂肪组织的方法，以本发明提供的冻存液与脂肪组织混合后，浸入液氮中。