[发明专利]一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用，高产L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶(PanD)的系列重组大肠杆菌是通过易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基而获得。利用高产PanD的基因工程菌可以高效转化L‑天冬氨酸来生物法制备β‑丙氨酸，其中，编号为6‑85的重组大肠杆菌的PanD酶活达到250U/L、β‑Ala的产量达8.5g/L左右，比亲株分别提高了近4倍和3倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种β-丙氨酸的制备，特别涉及一种利用随机突变获得系列panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

β-丙氨酸，又称β-氨基丙酸，由Ross和Monroe于1972年首次发现，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸是一种重要的化工原料和医药中间体，用于泛酸钙、肌肽、甜味剂等的合成，还被用作水的净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等。目前，β-丙氨酸的工业化生产主要通过化学法合成，根据合成原料的不同可分为丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺降解法、β-氨基丙腈法等。化学合成成本高、工艺要求严苛、产生大量腈类等有毒副产物，既不利于产品的分离纯化，又会导致严重的环境污染。

L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,简称PanD)能催化脱去L-天冬氨酸的α-羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳，因此，PanD能被用来生物法制备β-丙氨酸。上世纪七八十年代，Nakano、Williamson、Cronan等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内PanD合成β-丙氨酸，并对该酶的晶体结构和作用机理进行了研究。鉴于天然PanD的活性比较低，直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难，美国NSC技术有限公司在1996年首次通过基因重组技术，对大肠杆菌来源的panD基因进行了克隆表达，用于拆分DL-天冬氨酸。1999年，德国Dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的panD基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。发明专利(裘娟萍、高丽娟；一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用；申请号：200610155551.0；申请日：2006-12-28)也公开了一株大肠杆菌panD基因在大肠杆菌中重组表达的菌株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M206114)，并用于生物法制备β-丙氨酸。

尽管panD基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的PanD的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了PanD在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对panD基因进行了定点突变，以期研究PanD序列与功能的关系，为提高PanD的活力提供理论基础。定点突变是一种基于理性设计的分子改造。理性设计改善酶蛋白的酶学性质需要基于对蛋白的结构、功能和催化机制的掌握，根据蛋白的空间结构知识确定关键氨基酸位点进行取代、插入和缺失突变。因此，有效的理性设计需要大量的酶蛋白的信息、丰富的生物、物理和化学等学科知识储备及开阔的思维方式，往往难度较大；而且定点突变每次只有少数位点发生突变，对酶学性质的改造有限。相对而言，基于易错PCR的随机突变可在特定编码序列的多个位点产生随机突变，事先不需要对所改造蛋白的结构、功能和催化机制有深入了解，故其是一种较为理想的蛋白质定向进化方法。到目前为止，还未见用易错PCR的随机突变对PanD进行分子改造获得高活力PanD酶应用于β-丙氨酸的制备。

(三)发明内容

本发明目的是用易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基，从而提高重组大肠杆菌PanD的表达量，提供一系列panD突变基因和编码蛋白及提供一种高产PanD、制备β-丙氨酸的方法。

为了达到本发明的目的采用的技术方案是：