[发明专利]一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用

权利要求书

1.一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤(1)：取小麦种子50粒，用有效氯为1％次氯酸钠消毒液进行种子消毒，将消毒过的小麦种子放在垫有湿润无菌滤纸片的培养皿内，并透气性密封，置于室温下黑暗处萌发30h后获得无菌小麦芽，备用；

步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；所述番茄八氢番茄红素脱氢酶为番茄PDS；

步骤(3)农杆菌转化及培养：

3.1)将pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；

3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；

3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；

3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.₆₀₀＝0.3，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.₆₀₀值相同；

步骤(4)配制转化菌液：向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；

步骤(5)小麦芽侵染：将等量的处理过的小麦芽分别放入带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，记为玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1与TRV2的转化菌液，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器对玻璃瓶抽真空，每次保持15s，操作1～2次；最后，分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦芽和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转/min下过夜培养0-25小时；

培养结束，在超净台中，分别将经TRV1与TRV2转化菌液侵染过的小麦芽和经TRV1与TRV-SlPDS转化菌液侵染过的小麦芽用无菌水清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m^-2·s^-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养两天，移栽至土壤中继续生长，两周后观察表型，提取RNA使用半定量RT-PCR方法检测被沉默小麦中PDS基因转录本的沉默效果。

2.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(2)的详细操作步骤如下：cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；PDS基因扩增：以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系进行扩增；设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；pTRV-SlPDS基因沉默载体的构建：纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV-SlPDS基因沉默载体。

3.根据权利要求2所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，番茄PDS经PCR扩增后所得的番茄PDS基因片段与小麦PDS基因TaPDS的相似度为76.53％。