[发明专利]一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法

权利要求书

1.一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：

1)根据牦牛线粒体12S rRNA基因和黄牛12S rRNA基因的差异位点，设计标记引物和标记探针，所述标记引物包括上游引物和下游引物；

2)提取待测样品的全基因组DNA；

3)以所述步骤2)得到的待测样品全基因组DNA为模板，与所述步骤1)得到标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)用HRM法检测所述步骤3)得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉；

所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定；

所述差异位点的序列如SeqIDNo.1所示；

所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示；

所述标记探针3'末端用错配碱基封闭；

所述标记探针的序列如SeqIDNo.4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记探针的3'端糖环上C6被NH2封闭，阻止PCR过程探针自身的扩增。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的不对称PCR扩增的反应体系以12μL体系计量，包括以下组分：上游引物1μL，下游引物0.2μL，标记探针1μL，待测样品全基因组DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH2O1.8μL，LC Green 1μL。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的不对称PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中HRM法检测溶解的过程为：将所述PCR扩增产物从35℃升温至96℃，每升温0.025℃收集一次荧光信号，反应完成后降温至35℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述升温以恒定的速率0.1℃/s进行。