[发明专利]一种基于微结构的细胞捕获芯片及制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于微结构的细胞捕获芯片，其特征在于该芯片由双层结构组成，包括：上层液路通道结构和下层捕获微通道结构，上层液路通道结构包括细胞溶液入口、细胞溶液出口和液体通道；下层捕获微通道结构上设置有细胞捕获组件，其有不同尺寸及形状的微型通道沿边缘相互平行交错组成，液体通道中部与细胞捕获组件通过对准键合方法形成10±5μm的单个或多个封闭微结构，该微结构用于阻挡细胞形成对有限数量细胞的可控捕获。

2.根据权利1所述基于微结构的细胞捕获芯片，其特征在于所述微结构可以通过通道光刻胶两次曝光的方法及对准键合方法制得。

3.根据权利1所述基于微结构的细胞捕获芯片，其特征在于所述微结构长度及数量可以通过不同、通道组合和对准方法进行调控。

4.根据权利1所述基于微结构的细胞捕获芯片，其特征在于可通过调整微结构的长度和大小对捕获细胞的数量进行控制，可形成从单个细胞到几十个细胞的有效捕获。

5.根据权利1所述基于微结构的细胞捕获芯片，其特征在于可利用流体动力学原理对细胞进行捕获，并可在捕获后通过调整流体方向控制捕获细胞的释放操作。

6.根据权利要求1所述的基于微结构的细胞捕获芯片的制备方法，其特征在于它包括下列步骤：

步骤1.上层液路通道结构制作：玻璃芯片通道采用标准光刻和化学湿法刻蚀技术制备，采用商品化匀胶铬版，根据通道设计图案进行光刻，蚀刻深度为30-50μm；

步骤2.下层捕获微通道结构制作：首先制作细胞捕获组件阳性模板，在需要制作细胞捕获微结构的衬底硅片上涂敷光刻胶层SU-8，并且对光刻胶层进行加热固胶，采用第一图形(1)对光刻胶层进行第一次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h1,h1厚度为8-15μm；对带有第一图形结构的光刻胶进行后烘并涂敷第二层光刻胶层SU-8，加热固胶后采用第二图形(2)对光刻胶层进行第二次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h2,h1厚度为15-30μm；最后，将两次曝光作业后的光刻胶执行显影，保留第一图形和第二图形重叠部分；以上述光刻胶为阳性模板，在其上浇铸一定量PDMS，加热固化，剥离后即得具有相应阳模结构的基体细胞捕获组件；

步骤3.双层结构制作与芯片键合：将制作好相应通道的前述玻璃芯片与PDMS芯片同时经等离子体处理，迅速在其上滴加数滴甲醇，然后将上片盖在下片上，此时由于甲醇的存在，两片芯片可相互顺利滑动，将两层上的微通道平行对准，用滤纸吸去大部分多余水分，保持上下两层芯片位置并置于烘箱中80℃烘干，约30min后即可键合稳固而得到细胞捕获芯片，微结构长度可根据对准管道部分进行调整，上片需预留上下两层通道的出入口以进行进样操作和压力调整；

上述的制作双层结构细胞捕获芯片的方法，所述的步骤2可以进行微结构尺寸调控：可采用第二图形不同尺寸微通道进行组合形成不同尺寸的狭缝，用于调控捕获细胞的大小和数量。

7.一种基于微结构的细胞捕获芯片的应用，其特征在于，采用上述芯片，对单个及多个细胞进行捕获和释放，方法包括下述步骤：

步骤1.高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

步骤2.表面修饰：在常温下将1-10％牛血清白蛋白溶液溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

步骤3.细胞捕获：将含有细胞悬液以0.5微升/分钟通入样品通道；

步骤4.细胞固定：待进样5-10分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件上的细胞固定；

步骤5.细胞染色：在上述步骤4完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

步骤6.检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件上捕获的悬浮细胞。