[发明专利]复合酶制剂高效降解黄曲霉毒素B1的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶制剂领域，涉及一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素是一个典型的真菌次生代谢产物，其具有极强致癌、致畸、致突变性作用。黄曲霉的主要作用器官是肝脏，并能诱发肝细胞癌变，给人类和动物带来巨大的危害。黄曲霉毒素污染的范围比较广泛如花生、玉米、干果、牛奶等日常食物，因其毒性巨大，而越来越受关注。黄曲霉毒素对粮食的污染严重影响到各国的进出口贸易，给经济带来了巨大的损失。

黄曲霉毒素在结构上是由一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮环组成，其结构式中的不饱和内酯环结构以及双呋喃环是黄曲霉毒素强致癌性的原因。黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种，当内酯环结构被破坏时，荧光性会消失，毒性也会随之减弱，因此将毒素降解的关键是将其结构破坏。传统方法去除黄曲霉毒素主要有物理吸附、臭氧处理、酸碱调控处理、辐射处理，但是传统物理化学方法处理黄曲霉毒素包含降解效率低，副产物多，操作复杂，成本高昂的缺点，因此迫切需求一种安全高效降解黄曲霉毒素的方法。

生物法降解黄曲霉毒素成为当今的热点，利用具备降解能力的真菌或者细菌降解黄曲霉毒素。经研究微生物降解黄曲霉毒素主要分为微生物吸附和微生物降解两种。微生物对黄曲霉毒素的降解主

要是其所产酶起作用效果。研究不同菌体胞外酶按照一定的组分百分比混合制成复合酶制剂高效降解黄曲霉毒素B1的研究甚少。

发明内容

本发明在于提供一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法。

本发明的好食脉胞菌、雷斯青霉来自于实验室保藏，真菌漆酶源自于试剂公司购买。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微酶制剂：由好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂与真菌漆酶按照一定的组分百分比混合而成。

进一步在制备复合酶制剂时，由好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂以及真菌漆酶分别以一定的组分百分比混合而成，并确保各自所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且两组分之和为100%。

本发明高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）发酵培养好食脉胞菌以及雷斯青霉，并将各自培养液置于离心管内离心5500rpm离心10分钟，将上清液与下层菌体分开，将上清液超滤浓缩10倍，采用50%的饱和硫酸铵沉淀，10000转离心5分钟，弃去上清，将沉淀蛋白进行磷酸盐缓冲液复溶，透析过夜之后进行冷冻干燥，进而将得到蛋白作为好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂。

（2）将上述好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉的粗酶制剂和真菌漆酶

混合制成复合酶制剂，其中三者都满足所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分之和为100%。

利用国标法（编号：GB/T 17480-2008）检测黄曲霉毒素B1的含量。黄曲霉毒素B1降解率利用以下公式计算:降解率=(1-样品中AFB1峰面积/空白对照中AFB1的峰面积)×100%。

黄曲霉毒素B1的制取：取粉碎的玉米、花生、小麦于锥形瓶中，加入蒸馏水搅拌均匀，灭菌之后接种黄曲霉菌悬液，置于恒温培养箱培养一周左右，取被黄曲霉污染的样品与烧杯中，加入甲醇充分搅拌使黄曲霉素充分溶解，纱布过滤残渣，向滤液中加入氯仿充分振荡萃取，取下层氯仿于旋转蒸发仪蒸干，色谱甲醇溶解，并于0.22微米滤膜过滤，利于HPLC进样并收集黄曲霉毒素B1出峰区间的流出样，进而得到纯化的黄曲霉毒素B1，检测其纯度可达95%。

本发明在研究复合酶制剂降解黄曲霉毒素B1的过程中，充分考虑到环境因素对其降解效果的影响。经过研究发现，通过控制降解温度以及降解pH，在相同的温度以及pH下，复合酶制剂对黄曲霉毒素B1的降解能力相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别单独降解同等浓度的黄曲霉毒素B1的降解率有显著的提升。

本发明考虑到将降解黄曲霉毒素B1作用位点存在差异的酶混合，充分发挥不同种类酶在体系中的互补作用以及与酶在降解毒素的过程中相互促进作用。研究环境因素影响对复合酶制剂降解黄曲霉毒素B1效率的过程中，控制降解黄曲霉毒素B1的温度为33℃～37℃，pH为5～7.5，以及酶液浓度和作用时间等重要条件。复合酶制剂在同等条件下降解黄曲霉毒素B1的效率相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂与真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1的效率提高25%以上。