[发明专利]转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法

说明书

技术领域

本发明涉及棉花育种和种植领域，具体为一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法。

背景技术

转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种。抗虫基因通常为来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因，Bt基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因是抗虫棉中研究最多、进展最快、应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫有专一的杀伤作用,是一种具有特异杀虫活性的细菌，能产生多种对昆虫有特异活性的杀虫蛋白，包括cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，简称ICPs），以及营养期分泌的杀虫蛋白Vip（vegetative insecticidal protein，简称Vips）。且外源DNA表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。棉花抗虫育种历史不长，方法也不尽完善，转基因抗虫棉育种目标参考系统育种程序进行抗虫新品种的选育。在对品种进行农艺、经济和抗虫性状全面鉴定的基础上筛选出特别优良的转基因抗虫棉品种直接推广到生产中去利，杂种后代的处理必须将选种与抗虫鉴定相结合。在棉花选育品种过程中，通过不同性状的棉花株系进行杂交，以期获得具有不同亲本所携带的优良性状，并且一定要兼具抗虫特性，即后代材料要携带Bt基因。在转基因抗虫棉杂交后代材料中，含有大量无效或不可利用的杂交后代，在极其大量的后代材料中选择含有外源基因的目标植株是培育转基因抗虫棉的重要步骤，根据NPTⅡ基因（卡那霉素标记基因）与Bt抗虫基因紧密连锁的关系，因此在育种生产中，通过对植株抗卡那霉素特性的筛选，来获得带有Bt基因，具有抗虫特性的后代材料，转基因抗虫棉杂交后代的鉴别，一般来说，常用的方法有PCR扩增电泳检测法和田间卡那霉素涂抹鉴定法，PCR扩增电泳是目前最常用的实验室转基因植株遗传检测方法，PCR扩增电泳检测法存在诸多缺点，需要实验室和仪器，DNA制备过程复杂繁琐且实验技术要求高，大量转基因抗虫棉杂交后代需要鉴别时，实验试剂花费不菲且工作量极其巨大。田间卡那霉素涂抹鉴定，夏天高温作业，一株一叶涂抹，工作量大而繁重，受天气环境影响大且因操作的人为差异造成鉴定结果假阳性偏多，给后续的育种工作带来很大的麻烦。转基因抗虫棉杂交后代的遗传检测与筛选需要大量的工作要做，传统的PCR扩增电泳检测和田间卡那霉素涂抹已难以满足生产实验的需求。

发明内容

本发明目的在于寻求一种简便、快捷、高效的检测与筛选棉花转基因后代植株的方法，加以利用，以满足在棉花育种生产中，转基因抗虫棉杂交后代大量群体的筛选与鉴定需要。因此，专门就此要求设计了一套因地制宜、不同于实验室操作的、高效快捷、简便实用的技术方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，包括如下步骤：

（1）、材料准备

经农杆菌介导获得的转基因棉花植株，通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒，经灭菌处理后，浸泡于容器中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养；

（2）、接种培养

a、在器皿底部放入纱布或者毛巾，将150mg/L的卡那霉素溶液倒入器皿且湿透纱布或毛巾为宜，同时将已经灭菌处理的棉花种子接种到器皿中，在卡那霉素浸种萌发培养，光照培养或暗培养均可，培养温度28℃，培养时间，去种皮接种培养2天，直接放入培养不去种皮接种培养4天；

b、培养结束后，下胚轴生长较快的种子，测量伸长在2.3cm以上即为含有Bt抗虫基因的种子，作为育种资源利用的后代材料，不伸长或稍微伸长，则为不含有Bt抗虫基因的种子，是育种中应当放弃的材料。

本发明方法设计合理，把棉花转基因技术和种子发芽技术进行有机结合，对转基因抗虫棉杂交后代种质材料进行鉴别分离，去伪存真，简便、快速、高效地从转基因抗虫棉杂交后代种子中筛选出阳性转基因植株或株系，直接即可进行播种，减免了田间卡那霉素涂抹鉴定这一繁琐程序，提高育种工作的效率，缩短育种周期，具有很好的推广应用价值。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，包括如下步骤：

（1）、材料准备