[发明专利]一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用

权利要求书

1.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)芯片的制备：利用软蚀刻技术制备SU-8模板，含有高通量圆柱形的凹陷结构，底部为凹陷的曲面，对模板进行低黏附修饰；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS聚合物与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块形成围墙样结构的局限的开放培养池，得到高通量形成拟胚体的微阵列芯片。

2.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修饰具体为：采用低粘附处理试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。

3.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：微柱顶端为凸起的曲面结构，直径在500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。

4.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行拟胚体原位生长培养，具体步骤为：

(1)芯片无菌化：将上述拟胚体原位形成的微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后直接使用；

(2)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×10⁶-10×10⁶个hiPSCs/cm²细胞接种到(1)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632；静止培养24～48小时，形成大小一致的拟胚体；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x10⁶/cm²范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；

(3)拟胚体原位生长：拟胚体形成的24-48小时更换新鲜的不含Y27632的mTeSR1培养基继续培养，去除死亡细胞和细胞碎片，原位观察拟胚体生长及分化；

(4)所形成的拟胚体可以用于切片，组织染色。

5.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，其特征在于：应用对象不局限于人诱导性多潜能干细胞，同样适用于其他干细胞，包括人和动物的胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)以及动物来源的诱导性多潜能干细胞。