[发明专利]从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法及相关培养基

权利要求书

1.一种从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备细菌斜面固体培养基

按以下配方配制固氮培养基，并将配制的固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的固氮培养基灭菌25分钟，得到细菌斜面固体培养基，所述固氮培养基的成分为：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.01g、混合溶液10mL、氯化钠10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL；

(2)制备冰菜植物样品

a)取新鲜的冰菜样品，进行表面消毒，具体步骤如下：采用75％乙醇处理3～5min，之后用无菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸钠处理5min，再使用无菌水清洗3～5次；

b)称取5g表面消毒后的冰菜样品，加入灭菌研钵中，并加入10mL无菌生理盐水，研磨成匀浆溶液A；

c)吸取所述匀浆溶液A 1mL，加入9mL无菌生理盐水，振荡1分钟，得到10^-1的稀释匀浆溶液B；

d)吸取所述稀释匀浆溶液B 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10^-2的稀释匀浆溶液C；

e)吸取所述稀释匀浆溶液C 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10^-3的稀释匀浆溶液D；

f)吸取所述稀释匀浆溶液D 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10^-4的稀释匀浆溶液E；

g)吸取所述稀释匀浆溶液E 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10^-5的稀释匀浆溶液F；

(3)分别吸取所述稀释匀浆溶液D、稀释匀浆溶液E和稀释匀浆溶液F各0.2mL，加入到所述细菌斜面固体培养基中进行平板涂布培养，并在25～28℃下培养4～5天；

(4)从步骤(3)的培养结果中挑取菌落，选择20～200菌落数的培养皿在所述细菌斜面固体培养基中进行斜面培养，并在25～28℃下培养4～5天；

(5) 对步骤(4) 的培养结果进行分离，得到耐高盐固氮菌株；

所述固氮培养基中的混合溶液的组分为：钼酸钠 0.025g 、硫酸亚铁 0.001g 、三氯化铁 0.05g 、生物素 0.05g ，硫酸锰 0.02g 、硫酸铜 0.008g ，用蒸馏水定容至 100mL ，并且，定容后要用0.22 μ m 滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。

2.根据权利要求1所述的从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其特征在于，进一步包括：

(6)耐高盐固氮菌株的稳定生长

a)制备生长固氮培养基：按以下配方配制生长固氮培养基，并将配制的生长固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长固氮培养基灭菌25分钟，所述生长固氮培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠、混合溶液10mL、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL，并且，依据所述氯化钠的含量分别为10g、12g、15g、18g和21g而配制成多种不同的生长固氮培养基；

b)将所述步骤(5)得到的耐高盐固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化钠的不同生长固氮培养基中进行培养，在每种生长固氮培养基中在25～28℃条件下培养4～5天，最终纯化获得的菌株即为耐高盐固氮菌株；

所述生长固氮培养基中的混合溶液的组分为：钼酸钠0.025g、硫酸亚铁0.001g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。