[发明专利]用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片

说明书

本发明提供一种用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片，其包括：依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为微阀控制层、微阀薄膜层以及带有多个功能区的基板。微阀控制层上设有贯通控制层的孔，用于样品流入和流出，以及气体通道，用于气体通入；微阀薄膜层，在气体通道对应的薄膜层区域，在气压控制下可发生弯曲形变；基板上包含三个功能区，分别为杂质过滤区、细胞分离区和单细胞定位和荧光鉴定区。上述三个功能区由三条流体通道连接，每条流体通道的开启与闭合由单独的气体微阀控制。本发明实现了癌症患者血液中循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数，为循环肿瘤细胞分析领域提供了一种有效手段。

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域和医学诊断领域，具体地说，涉及一种用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC,Circulating Tumor Cell)，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗操作从实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC进入外周血后发生凋亡或者被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。近年来的研究表明，CTC存在与否及数量多少是癌症进展和转移的重要指标，检测和跟踪外周血中CTC的数量有助于对患者进行早期筛查、疗效监控、预后判断和复发预测。

目前，最常用的CTC检测方法是利用EpCAM(上皮细胞黏附分子)抗体免疫磁珠与细胞表面EpCAM蛋白的结合来富集CTC，再对癌细胞表面特异性蛋白进行免疫标记来鉴定。唯一被美国FDA认证批准的CellSearch就是利用该方法对CTC进行检测的，其检测过程包括样品孵育，细胞分离，免疫荧光标记和人工鉴定这几个主要步骤。许多实验室为了避免采用昂贵的CellSearch系统，研究人员尝试利用试管等廉价仪器进行人工分离和计数。

多年的实验室和临床研究证实了上述这类的方法的有效性，但依然有三类问题有待解决:A.较大的处理腔室影响了富集效率；B.不同腔室间的样品转移过程损失细胞；C.人工鉴定判读标准不一；D.检测时间过长。前三类问题影响了CTC技术精确性，后两类问题阻碍了CTC检测技术的临床推广。

微流控技术的出现为CTC检测提供了新的手段，微流控技术可以精确控制细胞以及细胞所处的环境(流场、磁场、电场等)，也可以将多个功能集成在一起以尽量避免细胞损失。因此，研究者已经通过设计特殊流道及纳米表面，控制磁场，集成片上荧光染色，结合cofocal等方法来提高富集效率，避免细胞损失和提升鉴定准确率。甚至还通过检测细胞尺寸大小，电学特性等方法，演示了无需抗体的检测。但目前临床实践中最迫切需求的是：1)不受人工判读影响的准确计数；2)快速的自动化检测。虽然微流控技术已经在各个方面都展示了优良的性能，但尚无一个芯片能够同时满足上述两个临床要求。

目前，关于微流控芯片中的细胞计数主要涉及到以下三类技术：

1、利用荧光显微镜进行人工计数：用微流控芯片对CTC进行捕获，再通过荧光显微镜进行人工计数。由于该技术需要样品在不同腔室之间进行转移，造成难以预计的细胞损失，再加上人工判读标准不一，导致计数精度不高。

2、利用流式细胞仪或者共聚焦荧光显微镜等进行自动计数：借助微流控芯片进行CTC捕获，在通过流式细胞仪进行精确计数。该技术避免了人工判读标准不一带来的计数误差，但是不同腔室间的样品转移依然无法避免，细胞损失不可预计。进行自动计数，虽然避免了样品损失和人工判读，但由于设备价格昂贵，一般实验室很难接受，普及难度高。

3、利用电场进行细胞计数。通过在微流控芯片中设计相应的测量电极，当细胞通过芯片通道时，不同细胞在电场下的阻抗或者电导率不同，产生不同的波峰，以此达到对目的细胞的计数目的。

目前，尚无能够将CTC捕获、鉴定及计数集成于一体的技术。

发明内容