[发明专利]一种中性粒细胞抗原底片的制备方法

说明书

本发明公开了一种中性粒细胞抗原底片的制备方法，包括以下步骤：将人的肝素抗凝血与的氯化钠溶液混合均匀，室温放置，吸取上层血浆；将上层血浆加入含有DextranT500的人淋巴细胞分离液中，充分混匀，离心，吸取沉淀在底部的白细胞层溶液，得到待离心溶液；将所述待离心溶液与LymphoprepTM分离液混合后，加入离心管中，将离心管置于水平式离心机内离心；吸取中性粒细胞层溶液，制备细胞悬浮液；将细胞悬浮液滴加在干净的载玻片上，自然风干，最后无水乙醇固定，得到中性粒细胞抗原底片。本发明的制备方法，解决了现有制备中性粒细胞抗原底片的方法中，存在中性粒细胞分布不均匀的问题，反应结果易观察。

技术领域

本发明属于抗原底片制备技术领域，具体涉及一种中性粒细胞抗原底片的制备方法。

背景技术

抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，指与中性粒细胞及单核细胞胞浆中溶酶体酶发生反应的抗体。对系统性血管炎炎症性肠病等多种疾病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义，已成为自身免疫性疾病的一项非常重要的常规检测项目。

间接荧光免疫方法是检测ANCA的参考方法或者标准方法，至今也是最常用的经典方法。该方法检测ANCA之前通常需要制备能与其发生反应的中性粒细胞抗原底片，当ANCA与中性粒细胞发生反应后，则可进行结果观察。

现有技术中，使用乙醇固定的中性粒细胞是最常用的抗原底片制备方法之一，首先将分离出的中性粒细胞涂布于载玻片上，然后通过乙醇固定，形成抗原底片，但是该方法制备的抗原底片存在细胞分布不均匀的问题，从而，当中性粒细胞与抗体反应后，不易观察反应结果，影响ANCA检测结果的观察判断。

发明内容

本发明提供的一种中性粒细胞抗原底片的制备方法，解决了现有制备中性粒细胞抗原底片的方法中，存在中性粒细胞分布不均匀的问题，反应结果易观察。

本发明提供的一种中性粒细胞抗原底片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将人的肝素抗凝血与0.5g/100g的氯化钠溶液按照4～6:1的体积比例混合均匀，室温放置，直至红细胞沉淀，吸取上层血浆，备用；

步骤2，将上层血浆加入含有DextranT500的人淋巴细胞分离液中，充分混匀，然后室温、3000r/min离心10-15min，吸取沉淀在底部的白细胞层溶液，得到待离心溶液；

其中，每100mL人淋巴细胞分离液中添加1.5g的DextranT500；

步骤3，将所述待离心溶液与LymphoprepTM分离液按1:3～5的体积比例混合后，加入离心管中，将离心管置于水平式离心机内，室温、1000-2000r/min离心30-35min；

步骤4，吸取中性粒细胞层溶液，加入4℃预冷的缓冲液，4℃、1000r/min离心5-10min，弃上清，收集细胞沉淀；

每升所述缓冲液由以下方法制备而成：5g的氯化钠、3g的氯化钾，蒸馏水定容至1L；

步骤5，向细胞沉淀中添加4℃预冷的0.8-0.9g/100g氯化钠溶液，使细胞数为5～5.5×10⁵个/mL，得到细胞悬浮液；

步骤6，将细胞悬浮液滴加在干净的载玻片上，自然风干，最后滴加4℃预冷的无水乙醇，固定5-8min，自然风干后得到中性粒细胞抗原底片。

优选的，上述中性粒细胞抗原底片的制备方法中，步骤1中，室温放置的时间为30-40min。