[发明专利]快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用

权利要求书

1.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的DNA条形码引物组合物，包括以下四对引物对：

第一引物对：

正向引物ybaL-F：5'-CCAACGTGGTACGGTGAGAA-3'，

反向引物ybaL-R：5'-AAAGGCTCGAACCTGGTAGC-3'；

第二引物对：

正向引物TAE3-F：5'-GTGCCATTGCTCACGGAATC-3'，

反向引物TAE3-R：5'-ATCACCGTACTCCGCAACTG-3'；以及

第三引物对：

正向引物PX_YPT35-F：5'-TCTACCGATTACGCTCTGCG-3'，

反向引物PX_YPT35-R：5'-TCGTCGTGACTGAAAATGGG-3'；

第四引物对：

正向引物HemK-F：5'-GCTATCCACTCCAGACAGCC-3'，

反向引物HemK-R：5'-GCGTGCAAACGAACCATCAT-3'，

其中，所述第一引物对为如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码的引物；所述第四引物对为如SEQ ID No.4所示的第四DNA条形码的引物。

2.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的试剂盒，包含根据权利要求1所述的DNA条形码引物组合物。

3.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求1所述的第一、第二、第三和第四引物对进行PCR扩增，如果未得到由所述四对引物分别扩增得到的PCR产物，则确定所述待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果得到由所述第一、第二、第三和第四引物对分别扩增得到的第一、第二、第三和第四PCR产物，则进行以下步骤；

c)对所得PCR产物进行测序，得到所述PCR产物各自的DNA序列，所述第一PCR产物的DNA序列为第一DNA序列，所述第二PCR产物的DNA序列为第二DNA序列，所述第三PCR产物的DNA序列为第三DNA序列，所述第四PCR产物的DNA序列为第四DNA序列；

d)将步骤c)得到的第一、第二、第三和第四DNA序列按顺序依次进行拼接，得到待测序列；将分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一、第二、第三和第四DNA条形码按顺序依次进行拼接，得到标准序列；将所述待测序列与所述标准序列进行序列同源性比对，如果序列同源性小于99％，则确定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007，如果序列同源性大于或等于99％，则进行步骤e)；

e)将所述待测序列与所述标准序列进行聚类分析，所述聚类分析为构建系统发育树，如果所述待测序列与所述标准序列经系统发育树分析后，待测菌株与TMCC 70007菌株处于同一个分支，且进化距离相同，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。

4.根据权利要求3所述的方法，其中由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度为547bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度为666bp；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为488bp；由所述第四引物对扩增得到的第四PCR产物的长度为679bp。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述PCR扩增的程序为：1)94℃-96℃预变性8分钟；2)94℃-96℃变性45秒，55℃-57℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸10分钟。

6.根据权利要求1所述的DNA条形码引物组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株中的应用。